[Sinh 10] Tài liệu ( vi sinh vật)

[canhcutndk16a.]

Đa dạng và các nhóm cổ khuẩn đại diện

Xét về các đặc điểm sinh lý, cổ khuẩn có thể phân thành bốn nhóm chính là sinh methane (methanogens), cổ khuẩn ưa nhiệt cao (hyper-therrmophiles), cổ khuẩn ưa mặn (halophiles) và cổ khuẩn ưa acid (acidophiles) thuộc lớp Thermoplasmatales với nhiều đại diện đã được phân lập và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

 

[canhcutndk16a.]

Cổ khuẩn sinh methane (methanogens)

T rong cổ khuẩn, các loài sinh methane làm thành một nhóm lớn và đa dạng với các đặc điểm chung là (1) tạo khí methane như sản phẩm cuối cùng của chu trình trao đổi năng lượng và (2) sống kỵ khí bắt buộc. Cổ khuẩn sinh methane thu năng lượng cho quá trình sinh trưởng từ việc chuyển hoá một số chất thành khí methane. Nguồn cơ chất chủ yếu của các vi sinh vật này là hydro, format và acetat. Ngoài ra, một số hợp chất C1 như metanol, trimethylamin, dimethylsulfid và rượu như isopropanol, isobutanol, cyclopentanol, etanol cũng được sử dụng làm cơ chất

Q uá trình sinh methane ở cổ khuẩn có thể coi như là quá trình hô hấp kỵ khí, trong đó chất nhận điện tử là CO2 hoặc nhóm methyl trong các hợp chất C1 và acetat. Tuy nhiên, như ta thấy trong bảng 4, năng lượng được giải phóng ra trong các phản ứng tạo methane đều rất nhỏ. Để so sánh ta có thể lấy năng lượng giải phóng từ phản ứng oxygen hoá glucoza bằng oxygen C6H12O6 + 6 O2 --> 6 CO2 + 6 H2O (∆G0’ = 2870 kJ/mol). Là những sinh vật duy nhất có khả năng tạo ra khí methane, cổ khuẩn sinh methane có những enzyme và coenzyme thiết yếu cho quá trình tổng hợp methane và đóng vai trò chỉ thị cho nhóm, ví dụ như coenzyme F420 và coenzyme M. Sự hiện diện của coenzyme F420 khiến cho các tế bào của cổ khuẩn sinh methane có tính tự phát sáng dưới ánh đèn huỳnh quang (bước sóng 350420 nm). Mặc dù hiện tượng tự phát sáng này có thể mạnh, yếu, hay đôi khi mất hẳn, tuỳ thuộc vào các pha sinh trưởng của tế bào, nhưng đó vẫn là một đặc điểm đơn giản và tiện lợi để nhận biết cổ khuẩn sinh methane dưới kính hiển vi. Bên cạnh đó, trình tự acid amin trong các chuỗi peptid của coenzyme M cũng được dùng để phân loại cổ khuẩn sinh methane. Những nghiên cứu trong lĩnh vực này cho thấy sự tương đồng giữa cây phân loại dựa trên trình tự 16S rARN và cây phân loại dựa trên trình tự acid amin của các đơn vị [TEX]\alpha [/TEX] và [TEX]\beta [/TEX] trong coenzyme M.

 

[canhcutndk16a.]

Cổ khuẩn sinh methane (methanogens) ( tiếp)

N hững nơi thông thường có thể tìm thấy cổ khuẩn sinh methane là các bể lên men hữu cơ kỵ khí, các lớp trầm tích thiếu oxygen, đất ngập úng và hệ đường ruột của động vật. Khi ở dạng chủng đơn cổ khuẩn sinh methane rất nhạy cảm với oxygen, tuy vậy trong tự nhiên chúng có thể tồn tại ở môi trường hiếu khí nhờ được bao bọc và bảo vệ bởi các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí khác. Trong môi trường kỵ khí, cổ khuẩn sinh methane phải cạnh tranh về cơ chất, đặc biệt là hydro và acetat, với các nhóm vi sinh vật sử dụng chất nhận điện tử có hiệu điện thế khử dương tính hơn so với CO2 như là nitơrat, sulfat và ôxit sắt III. Như vậy cổ khuẩn sinh methane sẽ chiễm lĩnh các môi trường nơi không có nhiều các loại chất nhận điện tử tiềm năng này. Do không có khả năng sử dụng rộng rãi các loại cơ chất khác nhau, trong tự nhiên cổ khuẩn sinh methane thường phải phụ thuộc vào các loài vi khuẩn lên men vì chúng chuyển hoá đa dạng chất hữu cơ thành các acid hữu cơ, hydro, format và acetate, trong đó hydro, format và acetate là nguồn thức ăn trực tiếp cho cổ khuẩn sinh methane, còn các acid hữu cơ sản phẩm của quá trình lên men như propyonat, butyrate thì cần phải được một nhóm vi khuẩn khác chuyển hoá thành cơ chất thích hợp rồi mới đến lượt cổ khuẩn chuyển thành khí methane. Có hai hình thức cộng sinh: bắt buộc và không bắt buộc. Trong hình thức cộng sinh giữa cổ khuẩn sinh methane và vi khuẩn lên men, chỉ có cổ khuẩn phụ thuộc vào mối liên hệ này do nhu cầu về thức ăn còn các hoạt động trao đổi chất của chúng hoàn toàn không có ảnh hưởng gì tới các vi khuẩn lên men, vì thế hình thức này được gọi là cộng sinh không bắt buộc.

Hình 9 : Cộng sinh giữa Methanobrevibacter (tế bào trực khuẩn) và Synthrophobacter (tế bào hình oval).
Cộng sinh bắt buộc diễn ra giữa cổ khuẩn sinh methane và một nhóm vi khuẩn cộng sinh bắt buộc, trong đó cả đôi bên cùng cần đến nhau, ví dụ như hiện tượng cộng sinh giữa Methanobrevibacter và Synthrophobacter (Hình 9). Nhóm vi khuẩn cộng sinh trong mối liên kết này oxygen hoá acid hữu cơ như propionate, các acid có mạch carbon dài hơn, các hợp chất thơm và chuyển điện tử sang proton hay CO2, tạo thành hydro hay format tương ứng. Nhóm vi khuẩn cộng sinh này chỉ có thể thực hiện được trao đổi chất khi nồng độ hydro và format trong môi trường xung quanh được giữ ở mức rất thấp, và nhiệm vụ đó do cổ khuẩn sinh methane đảm nhiệm. Các loài sinh methane thường có mặt trong mối liên kết cộng sinh bắt buộc là Methanoplanus endosymbiosus, các loài Methanobrevibacter, và Methanobacterium formicicum.
Ở một số môi trường đặc biệt như các suối nước nóng hay các tầng nham thạch núi lửa cổ khuẩn sinh methane thường có mặt với số lượng lớn. Trong trường hợp này chúng sống tự do, không phụ thuộc vào các vi sinh vật khác vì nguồn cơ chất chủ yếu được sử dụng ở đây là hydro, sản phẩm có được từ con đường lý hoá chứ không qua con đường sinh học.
H iện nay tổng số cổ khuẩn sinh methane được biết đến là 50 loài thuộc 19 chi, sáu họ và ba lớp (Bảng 5 và 6). Sự phân loại này dựa trên trình tự 16S rARN hiện có, tuy nhiên chúng ta có thể hình dung được rằng theo thời gian khi những loài mới được biết thêm thì có thể bảng phân loại này sẽ cần phải thay đổi.
Về hình thái, cổ khuẩn sinh methane rất đa dạng, trong đó một số loài có hình dạng đặc trưng dễ nhận biết dưới kính hiển vi như Methanosarcina, Methanospirillum hay Methanosaeta (Hình 10). Ngoài ra, một trong những đặc điểm quan trọng dùng để phân loại nhóm cổ khuẩn này là nguồn cơ chất có thể sử dụng để sinh methane (Bảng 6).
H ọ Methanobacteriaceae có thành tế bào cấu tạo từ pseudomurein, vì thế bắt mầu Gram (+). Họ Methanobacteriaceae gồm có ba chi là Methanobacterium, Methanobrevibacter và Methanosphaera. Các loài thuộc chi Methanobacterium có tế bào hình que hoặc hình sợi, đôi khi tạo nhóm gồm nhiều tế bào. Tất cả các loài thuộc chi này đều có khả năng sinh methane từ H2 + CO2, một số loài sử dụng.

 

[canhcutndk16a.]

Phương pháp thực nghiệm dùng để định tên các loài vi khuẩn

1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI:
1.1. Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):
2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%
0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất
Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.
• Dung dịch Iod:
Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.
• Dung dịch tẩy màu:
Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.
• Dung dịch nhuộm bổ sung:
Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
Các bước tiến hành:
• Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
• Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
• Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
• Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
• Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
• Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ.

Hình 1.1. Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả.

 

[canhcutndk16a.]

1.2. Nhuộm tiên mao
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A: Acid tannic 5 g
FeCl3 1,5 g
Formalin 2 ml
NaOH 1% 1 ml
Nước cất 100 ml
• Dung dịch B: 2 g AgNO3 hoà tan trong 100 ml nước cất, lấy 10 ml dể riêng. Nhỏ dung dịch NH4OH đậm đặc vào 90 ml còn lại, thấy hình thành tủa rất đặc, tiếp tục nhỏ NH4OH vào cho đến khi tan hết tủa. Lấy 10ml AgNO3 đã bỏ ra ban đầu nhỏ từ từ vào dung dịch, thấy xuất hiện váng mỏng, tiếp tục nhỏ vào cho đến khi vừa tan hết váng thì thôi.
• Chuẩn bị phiến kính: rửa thật sạch, ngâm trong cồn, đốt cháy hết cồn rồi mới sử dụng.
Các bước tiến hành:
• Hoạt hoá vi khuẩn 2-3 lần trước khi tiến hành nhuộm.
• Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ mặt thạch (mới cấy 18-24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất đặt giữa phiến kính, để nghiêng cho chảy về một phía, làm khô trong không khí.
• Cố định tế bào: hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
• Nhỏ dịch A lên vết bôi, giữ 10 phút, rửa bằng nước cất.
• Dùng dịch B cho chảy qua để loại hết nước. Nhuộm bằng dịch B trong 30-60 giây. Hơ nóng, để nguội rồi rửa lại bằng nước cất.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100x.
Kết quả:
Tế bào vi khuẩn bắt màu nâu thẫm, tiên mao bắt màu nâu.

Hình 1.2. Ví dụ minh hoạ kết quả nhuộm tế bào vi khuẩn và tiêm mao


1.3. Kiểm tra khả năng di động
Vật liệu, hoá chất:
• Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường thạch bán lỏng (0,3-0,6% thạch).
Các bước tiến hành:
• Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng.
• Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn.
Kết quả:
Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động.
Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động
Chú ý: với vi khuẩn hiếu khí chỉ quan sát ở phần trên của vết cấy.

 

[canhcutndk16a.]

1.4. Nhuộm bào tử
Có hai phương pháp nhuộm
1.4.1. Nhuộm Lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton)
Vật liệu, hoá chất:• Dung dịch Lục Malachite (Malachite green) bão hoà (khoảng 7,6%)
• Dung dịch Safranin 0,5% (xem nhuộm Gram)
Các bước tiến hành:• Làm vết bôi và cố định tế bào như đối với nhuộm Gram.
• Nhuộm bằng dung dịch Lục Malachite trong 10 phút, rửa nước.
• Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100
Kết quả:
Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.
Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục

1.4.2. Nhuộm Carbolic Fuchsin
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A:
10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong etanol (khoảng 10%)
100 ml dung dịch acid carbolic (phenol) 5% (trong nước).
Trộn đều với nhau (chuẩn bị trước khi dùng)
• Dung dịch B:
100 ml Etanol 95%
3 ml HCl đậm đặc
• Dung dịch C:
30 ml dung dịch Xanh metylen (Methylene blue) bão hoà trong etanol (khoảng 2%)
100 ml dung dịch KOH 0,01% trong nước.
Trộn đều với nhau, để càng lâu càng tốt.
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi trên phiến kính, cố định tế bào.
• Nhỏ dung dịch A lên vết bôi, hơ nóng nhẹ bên dưới để bay hơi, tránh để sôi. Thêm dần dần thuốc nhuộm để không bị khô cạn, giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm đi.
• Dùng dịch B rửa cho đến khi vừa thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước.
• Nhuộm lại bằng dung dịch B trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu.
Kết quả:
Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh

Hình 1.3. Các bước tiến hành nhuộm Carbolic Fuchsin và ví dụ minh hoạ kết quả.

 

[canhcutndk16a.]

1.5. Nhuộm vỏ nhầy (Capsule)
1.5.1. Phương pháp nhuộm âm bản
Vật liệu, hoá chất:
• Mực tàu
• Metanol
• Dung dịch safranin 0,5%
Các bước tiến hành:
• Lấy vi khuẩn hoà vào giọt nước trên phiến kính.
• Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều. Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm khô trong không khí.
• Cố định vết bôi bằng cách nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1 phút.
• Thêm dần dần dung dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau đó giữ trong 30 giây để nhuộm lại, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
Nền vi trường màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng.
1.5.2. Phương pháp Đỏ Congo
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Đỏ Congo (Congo red) 2% trong nước
• Dung dịch gelatin 0,01-0,1% trong nước
• Dung dịch HCl 1%
• Hỗn hợp 30 ml dung dịch Xanh metylen bão hoà (khoảng 2%) trộn với 100 ml dung dịch KOH 0,01%.
Các bước tiến hành:
• Nhỏ 1 giọt dung dịch Đỏ Congo và 1 giọt dung dịch gelatin lên phiến kính sạch.
• Lấy vi khuẩn trộn đều với 2 giọt nói trên để làm vết bôi, để khô trong không khí
• Nhỏ dung dịch HCl lên để rửa, phiến kính có màu xanh.
• Rửa bằng nước để loại bỏ dung dịch HCl.
• Nhuộm lại bằng Xanh metylen trong 1 phút, rửa nước, hong khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu
1.5.3. Phương pháp nhuộm âm bản đơn giản (Hình 1.4):
• Nhỏ 1 giọt Nigrosin vào đầu một phiến kính sạch.
• Lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn trộn với giọt nigrosin.
• Lấy một phiến kính khác để nghiêng 450 và kéo giọt nigrosin đã trộn vi khuẩn về phía phải một chút sau đó kéo nhẹ về phía trái để dàn mỏng thành một vết bôi. Để khô tự nhiên (không hơ lửa).
• Quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy vỏ nhầy màu sáng nổi lên trên một nền màu đen.

Hình 1.4. Nhuộm âm bản dùng Nigrosin và ví dụ minh hoạ kết quả.

1.5.4. Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Tím kết tinh 1% trong nước
• Dung dịch Sulfat đồng CuSO4 20% trong nước
Các bước tiến hành:
• Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính sạch
• Lấy vi khuẩn từ ống thạch nghiêng (48 giờ) trộn với dung dịch tím kết tinh, dùng cạnh lam kính dàn đều trên toàn bộ phiến kính để làm vết bôi, giữ trong không khí 5-7 phút để làm khô, không được hơ nóng.
• Rửa vết bôi bằng dung dịch sulfat đồng 20%, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
• Tế bào có màu sẫm, vỏ nhày màu nhạt ở xung quanh.

 

[canhcutndk16a.]

1.5. Nhuộm vỏ nhầy (Capsule)
1.5.1. Phương pháp nhuộm âm bản
Vật liệu, hoá chất:
• Mực tàu
• Metanol
• Dung dịch safranin 0,5%
Các bước tiến hành:
• Lấy vi khuẩn hoà vào giọt nước trên phiến kính.
• Nhỏ thêm 1 giọt mực tàu, trộn đều. Dùng cạnh lamen dàn mỏng vết bôi, làm khô trong không khí.
• Cố định vết bôi bằng cách nhỏ metanol lên vết bôi, giữ trong 1 phút.
• Thêm dần dần dung dịch Safranin 0,5% lên vết bôi để rửa metanol, sau đó giữ trong 30 giây để nhuộm lại, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
Nền vi trường màu đen, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy màu hồng.
1.5.2. Phương pháp Đỏ Congo
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Đỏ Congo (Congo red) 2% trong nước
• Dung dịch gelatin 0,01-0,1% trong nước
• Dung dịch HCl 1%
• Hỗn hợp 30 ml dung dịch Xanh metylen bão hoà (khoảng 2%) trộn với 100 ml dung dịch KOH 0,01%.
Các bước tiến hành:
• Nhỏ 1 giọt dung dịch Đỏ Congo và 1 giọt dung dịch gelatin lên phiến kính sạch.
• Lấy vi khuẩn trộn đều với 2 giọt nói trên để làm vết bôi, để khô trong không khí
• Nhỏ dung dịch HCl lên để rửa, phiến kính có màu xanh.
• Rửa bằng nước để loại bỏ dung dịch HCl.
• Nhuộm lại bằng Xanh metylen trong 1 phút, rửa nước, hong khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
Nền vi trường màu xanh, tế bào màu đỏ, vỏ nhầy không màu
1.5.3. Phương pháp nhuộm âm bản đơn giản (Hình 1.4):
• Nhỏ 1 giọt Nigrosin vào đầu một phiến kính sạch.
• Lấy 1 vòng que cấy vi khuẩn trộn với giọt nigrosin.
• Lấy một phiến kính khác để nghiêng 450 và kéo giọt nigrosin đã trộn vi khuẩn về phía phải một chút sau đó kéo nhẹ về phía trái để dàn mỏng thành một vết bôi. Để khô tự nhiên (không hơ lửa).
• Quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy vỏ nhầy màu sáng nổi lên trên một nền màu đen.

Hình 1.4. Nhuộm âm bản dùng Nigrosin và ví dụ minh hoạ kết quả.

1.5.4. Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Tím kết tinh 1% trong nước
• Dung dịch Sulfat đồng CuSO4 20% trong nước
Các bước tiến hành:
• Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính sạch
• Lấy vi khuẩn từ ống thạch nghiêng (48 giờ) trộn với dung dịch tím kết tinh, dùng cạnh lam kính dàn đều trên toàn bộ phiến kính để làm vết bôi, giữ trong không khí 5-7 phút để làm khô, không được hơ nóng.
• Rửa vết bôi bằng dung dịch sulfat đồng 20%, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
• Tế bào có màu sẫm, vỏ nhày màu nhạt ở xung quanh.

 

[canhcutndk16a.]

1.5.4. Phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch Tím kết tinh 1% trong nước
• Dung dịch Sulfat đồng CuSO4 20% trong nước
Các bước tiến hành:
• Nhỏ vài giọt dung dịch tím kết tinh lên phiến kính sạch
• Lấy vi khuẩn từ ống thạch nghiêng (48 giờ) trộn với dung dịch tím kết tinh, dùng cạnh lam kính dàn đều trên toàn bộ phiến kính để làm vết bôi, giữ trong không khí 5-7 phút để làm khô, không được hơ nóng.
• Rửa vết bôi bằng dung dịch sulfat đồng 20%, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
• Tế bào có màu sẫm, vỏ nhày màu nhạt ở xung quanh.

1.6. Nhuộm thành tế bào
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch acid tannic 5%
• Dung dịch Tím kết tinh 0,2%
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi vi khuẩn
• Nhuộm bằng dung dịch acid tannic trong 5 phút, rửa nước.
• Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 3-5 phút, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100
Kết quả:
• Thành tế bào bắt màu tím, tế bào chất màu tím nhạt.

1.7. Nhuộm hạt dị nhiễm
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A: Xanh Toluidin (Toluidine blue) 0,15 g
Lục malachite 0,2 g
Acid acetic (glacial) 1 ml
Ethanol 95% 2 ml
Nước cất 100 ml
• Dung dịch B: Iod (I) 2 g
Iodid kali (IK) 3 g
Nước cất 300 ml
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi, cố định vết bôi.
• Nhuộm bằng dịch A trong 5 phút, đổ đi
• Tráng bằng dịch B, nhuộm thêm trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100.
Kết quả:
Các hạt dị nhiễm có màu đen.
Các thành phần khác của tế bào bắt màu lục hay lục nhạt

 

[canhcutndk16a.]

1.8. Nhuộm hạt PHB (Poly-β-hydroxybutyric acid)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A: Đen Sudan B (Sudan black B) 0,3 g
Etanol 70% 100 ml.
Trộn đều, lắc mạnh, để qua đêm mới sử dụng.
• Dung dịch B: Xylene
• Dung dịch C: Dung dịch Safranin 0,5% trong nước.
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi, cố định vết bôi.
• Nhuộm bằng dịch A trong 10 phút, rửa nước, thấm khô.
• Dùng dịch B rửa cho đến khi mất màu.
• Nhuộm bằng dịch C trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính dầu 100
Kết quả:
Hạt PHB bắt màu lam đen. Tế bào và các bộ phận khác có màu đỏ.

1.9. Nhuộm tinh thể protein (ở Bacillus thuringiensis)
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch nhuộm:
1 ml dung dịch Fuchsin bão hoà bão hoà (xem nhuộm carbolic fuchsin) trộn với 100 ml dung dịch acid carbolic 5% trong nước.
Khi dùng pha loãng 10 lần.
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi, cố định vết bôi
• Nhuộm trong 1 phút, rửa nước, hong khô
• Soi kính: dùng vật kính dầu
Kết quả:
Tinh thể bắt màu đỏ. Bào tử tách rời có vòng màu đỏ

1.10. Nhuộm vi khuẩn kháng acid
Vật liệu, hoá chất:
• Dung dịch A:
Dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong nước ( 10%) 10 ml
Dung dịch acid carbolic 5% trong nước 100 ml
Trộn đều 2 dung dịch với nhau.
• Dung dịch B:
Etanol 95% 100 ml
HCl đặc 3 ml
• Dung dịch C:
Dung dịch Xanh metylen bão hoà trong etanol ( 2%) 30 ml
Dung dịch KOH 0,01% trong nước 100 ml
Các bước tiến hành:
• Làm vết bôi, cố định
• Nhỏ dịch A lên vết bôi, đun nhẹ dưới phiến kính cho bay hơi nhưng không sôi. Thường xuyên bổ sung thêm dịch A để tránh khô vết bôi. Giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ dịch A đi.
• Dùng dịch B rửa cho đến khi thấy vừa mất màu đỏ. Rửa nước kỹ.
• Nhuộm bằng dịch C trong 2-3 phút, rửa nước, thấm khô.
• Soi kính: dùng vật kính 40
Kết quả:
Vi khuẩn kháng acid bắt màu đỏ.
Vi khuẩn không kháng acid bắt màu xanh.

Hình 1.5. Ví dụ minh hoạ kết quả xác định tính kháng acid của vi khuẩn.

 

[canhcutndk16a.]

2. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ:
2.1. Hình thái khuẩn lạc
• Lấy 15-20ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 50 0C rồi đổ vào đĩa Petri (thao tác vô trùng). Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủ ấm 30-37 0C để làm khô mặt thạch.
• Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch ở một góc. Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước. Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy. Chú ý không nhấc tay lên và không thay đổi hướng của vòng que cấy.
• Đặt vào nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày để chọn ra các khuẩn lạc mọc riêng rẽ.
• Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)

Hình 2.1. Cấy ria tế bào để tách khuẩn lạc đơn và các dạng khuẩn lạc thường gặp.

2.2. Nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt
• Lấy một vòng que cấy sinh khối cấy vào các ống nghiệm có môi trường dinh dưỡng thích hợp (môi trường thạch hoặc dịch thể).
• Đặt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (3 ống trong một nhiệt độ). Đối với các loài ưa ấm (mesophiles), nhiệt độ sinh trưởng và tính bền nhiệt thường được kiểm tra với thang nhiệt độ 4, 20, 30, 37, 41, 45 và 65 0C. Từ 37 0C trở lên có thể dùng các nồi cách thủy ổn nhiệt.
• Quan sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn (tạo sinh khối trên môi trường thạch, hoặc đo OD nếu thí nghiệm được tiến hành trên môi trường dịch thể)
Đặc biệt, tính bền nhiệt cần xác định khi phân loại các Liên cầu khuẩn, cách làm như sau:
• Cấy 1 giọt dịch nuôi cấy 24 giờ vào ống nghiệm đựng môi trường dịch thể thích hợp.
• Giữ ở nồi cách thủy 60 0C trong 30 phút sau đó đặt vào tủ ấm 35-37 0C, nuôi trong 48 giờ.
Nếu vi khuẩn phát triển được là có tính bền nhiệt. Dùng chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis làm đối chứng dương tính.

 

[canhcutndk16a.]

2.3. Nhu cầu về O2 và CO2
Căn cứ vào nhu cầu đối với ôxy, vi khuẩn được thành các nhóm hiếu khí, kỵ khí, kỵ khí không bắt buộc và vi hiếu khí.
2.3.1. Nhu cầu đối với ôxy
• Vi khuẩn đã hoạt hoá cấy vào môi trường dịch thể thích hợp.
• Đặt ở các điều kiện: - không khí chứa 5% CO2 và 10% O2
- không khí bình thường.
Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.

2.3.2. Tính kỵ khí của vi khuẩn sinh bào tử
• Chuẩn bị môi trường thạch kỵ khí:
Casein thủy phân 20 g
NaCl 5 g
Na-mercaptoacetat 2 g
Na-formaldehyd sulfoxylate 1 g
Thạch 15 g
Nước cất 1000 ml.
• Cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu 1 vòng que cấy (đường kính 1,5 mm) vào môi trường nói trên.
• Nuôi ở 30 0C, kiểm tra kết quả sau 3 ngày và 7 ngày. Nếu vi khuẩn mọc ở phía trên là thuộc loại hiếu khí; nếu mọc dọc đường cấy là kỵ khí không bắt buộc; nếu chỉ mọc bên dưới là kỵ khí bắt buộc.

2.4. Khả năng đồng hóa các nguồn carbon
• Môi trường khoáng cơ bản (g/l):

(NH4)2SO4 2 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NaH2PO4.H2O 0,5 g
CaCl2.2H2O 0,1 g
K2HPO4 0,5 g
Nước cất 1000 ml
• Nguồn carbon (đường, polysaccarid, rượu, axit béo, axit amin, axit hữu cơ, hydroxy axit (alcohol axit, dicarboxylic axit…) được khử trùng qua màng lọc.
• Bổ sung nguồn carbon vào môi trường khoáng cơ bản (đường và rượu ở nồng độ 0,5-1%, các loại khác ở nồng độ 0,1-0,2%), chia môi trường vào các ống nghiệm đã tiệt trùng.
• Cấy vi khuẩn vào môi trường, sử dụng 3 ống nghiệm đối với mỗi loại nguồn carbon.
• Theo dõi sự phát triển để đánh giá khả năng đồng hóa nguồn carbon.
Cách khác là chuẩn bị môi trường khoáng cơ sở có thạch và đổ đĩa Petri. Vi khuẩn được cấy dàn đều trên đĩa bằng que gạt. Nguồn carbon ở dạng tinh thể được đưa lên đĩa (khoảng bằng hạt gạo) để cho khuyếch tán dần ra xung quanh. Nếu vi khuẩn đồng hóa được nguồn carbon nào sẽ mọc thành vòng xung quanh chỗ có đặt nguồn carbon đó.

Các nguồn carbon thường được dùng trong thí nghiệm:
Đường 5C : Arabinoza, Riboza, Xyloza, Fucoza, Rhamnoza
Đường 6C Glucoza hay Dextroza, Mannoza, Sorboza, Fructoza hay Levuloza, Galactoza
Đường kép Saccharoza hay Sucroza-Đường kính, Maltoza, Sorboza, Lactoza, Trehaloza, Cellobioza, Melibioza
Đường tam Raffinoza, Melizitoza
Đường đa Tinh bột (Starch), Dextrin, Inulin, Glycogen
Rượu bậc 3 Glycerol
Rượu bậc 4 Erythritol
Rượu bậc 5 Adonitol, Arabitol, Xylitol
Rượu bậc 6 Mannitol, Sorbitol, Dulcitol
Rượu bậc 6 mạch vòng Inozitol
Glucoside Salicin, Coniferrin, Aesculin, Arbutyl, Amygdalin, alpha-Methylglucosid

 

[canhcutndk16a.]

2.5. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ
• Môi trường cơ sở:
KH2PO4 1,36 g
CaCl2 5 ml
NaHPO4. 2,13 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,5 ml
Glucoza 10 g
Nước cất 1000 ml
Glucoza có thể được thay thế bằng nguồn carbon thích hợp khác như Citrat, Acetat, Mannit… với nồng độ 0,2-0,5%. Các nguồn nitơ khác nhau (muối ammon, muối nitơrat) được đưa vào môi trường với nồng độ 0,05-0,1%. Đối chứng là môi trường hoàn toàn không bổ sung nguồn nitơ. Chỉnh pH tới 7,0-7,2.
Chia môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml/ ống), khử trùng ở 112 0C trong 20-30 phút.
• Cấy vi khuẩn đã hoạt hoá 18-24 giờ (3 ống cho mỗi loại nguồn nitơ).
• Đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3 ngày và 7 ngày. So sánh sự phát triển với đối chứng (đo độ đục của dịch tế bào) để xác định khả năng đồng hóa nguồn nitơ.

2.6. Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang
• Môi trường làm ống thạch nghiêng:
Pepton 20 g
Glyxerin 10 g
K2HPO4 1,5 g
MgSO4.7H2O 1,5 g
Thạch 15 g
Nước cất 1000 ml
pH = 7,2.
Khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, đặt thạch nghiêng.
• Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa 24 giờ lên mặt thạch, đưa vào tủ ấm và theo dõi sau 1, 3, 5 ngày.
• Quan sát ống nghiệm dưới đèn tử ngoại xem có sản sinh sắc tố huỳnh quang hay không?

 

[canhcutndk16a.]

2.7. Tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn
• Chuẩn bị môi trường thạch đĩa thích ứng với từng loại vi khuẩn.
• Cấy gạt vi khuẩn lên mặt thạch đĩa (có thể trộn vi khuẩn vào môi trường thạch đã làm nguội tới 50 0C rồi đổ đĩa).
• Đặt lên mặt thạch các khoanh giấy (tự chế hoặc mua sẵn) tẩm chất kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau.
• Nuôi trong tủ ấm 30 0C trong 24-48 giờ.
• Quan sát các vòng vô khuẩn tạo thành xung quanh các khoanh giấy chứa chất kháng khuẩn. Vòng vô khuẩn càng lớn tức là vi khuẩn càng mẫn cảm.

Hình 2.2. Vòng vô khuẩn tạo thành quanh các khoanh giấy thấm chất kháng khuẩn.


2.8. Đồng hóa Malonat

• Môi trường dịch thể:
Cao men 1 g
(NH4)2SO4 2 g
K2HPO4 0,6 g
KH2PO4 0,4 g
Natri malonat 3 g
Bromophenol blue (BPB) 0,025 cg
Nước cất 1000ml
pH= 7,0-7,4
• Chia môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.
Đối chứng là môi trường không có Natri-malonat.
• Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày.
• Quan sát sự đổi mầu của môi trường: nếu chuyển màu từ lục sang lam là có đồng hóa malonat (dương tính), nếu không là âm tính.

Hình 2.3. Sự đổi mầu của môi trường khi vi khuẩn đồng hoá malonat.

 

[canhcutndk16a.]

2.9. Xét nghiệm đồng hóa Citrat

Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuẩn đường ruột dựa trên khả năng đồng hoá citrat.
• Môi trường Simmons:
NaCl 5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NH4H2PO4 1 g
K2HPO4.3H2O 1 g
Natri xitrat 2 g
BPB 1% trong nước 10 ml
Thạch (đã rửa nước) 12 g
Nước cất 990 ml.
Đun tan thạch, chỉnh pH đến 7,0, thêm chỉ thị màu BPB và phân vào ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Khử trùng ở 121 0C trong 15 phút.
• Cấy vi khuẩn vào ống thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 3-7 ngày.
• Môi trường biến màu từ lam sang đỏ đào tức là vi khuẩn có khả năng đồng hóa citrat (dương tính).
• Với các loài Bacillus cần sử dụng môi trường sau:
NaCl 1 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NH4H2PO4 0,5 g
Natri xitrat 2 g
Nước cất 1000 ml
Đỏ phenol (Phenol red) 0,04% 20 ml.

2.10. Nhu cầu muối và tính chịu muối
• Chuẩn bị môi trường dịch thể thích hợp đối với từng loài vi khuẩn.
• Bổ sung NaCl ở các nồng độ 2, 5, 7, 10%, môi trường cần trong suốt.
• Cấy vi khuẩn đã hoạt hóa, ủ trong 3-7 ngày.
• Theo dõi mức độ sinh trưởng của vi khuẩn (môi trường không cấy vi khuẩn làm đối chứng).

2.11. Khả năng đồng hóa Tartrat
• Môi trường dịch thể để kiểm tra:
Pepton 10 g
NaCl 5 g
Nước cất 1000 ml
BPB (0,2%) 12,5 ml
Kali tartrat 10 g
Chỉnh pH = 7,4.
Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 115 0C trong 20 phút, nên dùng ngay. Nếu để môi trường quá 14 ngày thì cần khử trùng lại bằng đun cách thủy 10 phút.
• Cấy vi khuẩn vào môi trường, hàng ngày theo dõi sự đổi màu.
• Sau 14 ngày thêm một lượng dung dịch chì acetat bão hòa trung tính bằng thể tích môi trường (vol/vol). Đối chứng là môi trường không cấy vi khuẩn.
• Nếu có chuyển sang màu lục vàng và có ít chì acetat kết tủa là có khả năng đồng hóa tartrat (dương tính). Nếu màu vàng hay màu lục và có nhiều chì acetat kết tủa là xét nghiệm âm tính.
• Phản ứng này dùng để phân biệt Salmonella zava (dương tính) và Salmonella paratyphi B (âm tính).

2.12. Khả năng sinh trưởng với KCN
KCN có tác dụng ức chế Escherichia coli nhưng không ức chế Citrobacter freundi, vì thế thường được dùng để phân biệt 2 loài này.
• Môi trường cơ sở:
Pepton 3 g
NaCl 5 g
KH2PO4 0,22 g
K2HPO4 5,64 g
Nước cất 1000 ml.
pH = 7,6.
Khử trùng ở 115 0C trong 20 phút. Để môi trường vào tủ lạnh cho nguội đến 4 0C, thêm 15ml dung dịch KCN 0,5%, phân vào mỗi ống nghiệm 1ml (thao tác vô trùng); có thể bảo quản được trong 2 tuần. Môi trường đối chứng không thêm dung dịch KCN.
• Cấy vi khuẩn từ mới hoạt hoá (24 giờ) vào các môi trường đã chuẩn bị trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 4 ngày và quan sát sự chuyển màu của môi trường.
• Nếu môi trường chuyển màu đỏ là sinh trưởng dương tính (Citrobacter freundii), nếu môi trường vẫn không màu là sinh trưởng âm tính (Escherichia coli).

 

[canhcutndk16a.]

3. CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA:
3.1. Xét nghiệm oxidaza
Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuản dựa trên hoạt tính cytochrom oxidaza
• Pha dung dịch Tetramethyl-p-phenylen diamin dihydrochlorid (TPPDD) 1% trong nước, bảo quản trong lọ màu tối ở 4 C, sử dụng trong 2 tuần.
• Đặt một miếng giấy lọc trong nắp hộp Petri sạch, nhỏ dung dịch TPPDD 1% lên trên miếng giấy lọc sao cho vừa đủ ẩm, không để quá ướt.
• Dùng que cấy có đầu que làm bằng sợi platin hay dùng đũa thủy tinh (không dùng đầu que cấy bằng sợi kim loại sắt, niken...) lấy một ít vi khuẩn đã hoạt hoá (18-24 giờ) bôi lên miếng giấy lọc.
• Sau 10 giây nếu vi khuẩn chuyển sang màu hồng tức là có oxydaza dương tính; nếu sau 60 giây mới chuyển màu là oxydaza âm tính.
• Chú ý: nếu dung dịch đã tự chuyển sang màu hồng rồi thì không được sử dụng. Nếu giấy lọc quá ướt sẽ cản trở khuẩn lạc tiếp xúc với không khí nên chuyển màu chậm, tạo nên âm tính giả.

3.2. Xét nghiệm catalaza
Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.
• Chuẩn bị dung dịch H¬2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.
• Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính.
• Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.
• Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự.

Hình 3.1. Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H2O2 của vi khuẩn có catalaza dương tính.

 

[canhcutndk16a.]

3.3. Khả năng lên men/ôxy hóa glucoza
Có thể dùng một trong hai môi trường sau để làm thí nghiệm
• Môi trường I:
Pepton 2 g
NaCl 5 g
K2HPO4 0,2 g
Glucoza 10 g
Thạch 6 g
Dung dịch BTB 1% 3 ml (pha trong một ít cồn 95%, sau đó mới thêm nước để thành dung dịch 1%)
Nước cất 1000 ml.
pH = 7,0 - 7,2.
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 20 phút.
• Môi trường II:
NH4H2PO4 0,5 g
K2HPO4 0,5 g
Cao men 0,5 g
Glucoza 10 g
Thạch 5-6 g
Dung dịch BTB 1% 3 ml (pha như trên)
Nước cất 1000 ml
pH = 7,0 - 7,2.
Phân môi trường vào ống nghiệm và khử trùng như trên.
• Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 h) cấy chích sâu vào môi trường bằng que cấy thẳng (mỗi chủng vi khuẩn cấy vào 4 ống). Bịt kín 2 ống nút bông bằng vaselin-paraffin (lấy vaselin làm chảy ra, thêm 1/3 dầu paraffin) để cách ly với không khí. Ngoài ra lấy thêm 2 ống không cấy vi khuẩn làm đối chứng. Theo dõi kết quả sau 1,2,3,7 và 14 ngày.
• Kết quả: - Nếu chỉ có ống không bịt kín sinh axit (chuyển màu vàng)
tức là vi khuẩn thuộc dạng ôxy hóa.
- Nếu cả ống không bịt và ống bịt kín đều sinh axit (chuyển màu vàng) tức là vi khuẩn thuộc dạng lên men.

3.4. Khả năng lên men đường, rượu
• Môi trường:
Cao thịt 3 g
Pepton 10 g
NaCl 5 g
Chất chỉ thị màu Andrade* 10 ml
(hay dung dịch Xanh bromophenol 0,2%)
Nước cất thêm đến 1000 ml
• Bổ sung đường với nồng độ 0,5%. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 1ml.
• Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 121 0C. Đường arabinoza, xyloza, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường.
* Cách pha chất chỉ thị màu Andrade:
Fuchsin axit 0,5 g
NaOH 1M 16 ml
Nước cất 100 ml
Nếu dung dịch có màu hồng, dùng NaOH 0,1 M (1-2 ml) để trung hòa cho đến khi mất màu.
Xanh bromophenol (BPB):
2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M, nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml.
• Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày
• Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) thì chất chỉ thị Andrade sẽ chuyển màu đỏ, chất chỉ thị BPB sẽ chuyển màu vàng lục.
Có thể làm cách khác như sau:
• Với vi khuẩn nói chung dùng môi trường I (xem mục 3.3), thay glucoza các đường khác hay rượu (nồng độ 1).
• Với vi khuẩn sinh bào tử dùng môi trường sau:
(NH4)2HPO4 1 g
KCl 0,2 g
MgSO4 0,2 g
Cao men 0,2 g
Thạch 5-6 g
Đường hay rượu 10 g
Nước cất 1000 ml
Dung dịch BTB 0,04% 15 ml
pH = 7,0-7,2.
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 112 0C trong 30 phút.
• Với vi khuẩn lactic dùng môi trường sau:
Pepton 5 g
Cao thịt 5 g
Cao men 5 g
Tween 80 0,5 ml
Thạch 5-6 g
Nước cất (hay nước máy) 1000 ml
Dung dịch BTB 1,6% 1,4 ml
pH = 6,8-7,0.
Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng tại 112 0C trong 30 phút.
• Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) cấy trích sâu vào môi trường thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1,3,5 ngày.
• Nếu chỉ thị màu biến vàng là vi khuẩn có khả năng lên men sinh axit (phản ứng dương tính); nếu vẫn giữ màu lam là phản ứng âm tính.

 

[canhcutndk16a.]

3.5. Phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red)• Môi trường:
Pepton 5 g
Glucoza 5 g
K2HPO4 hoặc¬ NaCl 5 g
Nước cất 1000 ml.
pH = 7,0 - 7,2.
Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 0C trong 30 phút.
• Thuốc thử:
Đỏ Methyl 0,1 g
Etanol 95% 300 ml
Nước cất 200 ml.
• Cấy vi khuẩn vào môi trường (lặp lại 2 lần), đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày (nếu kết quả âm tính cần kéo dài thêm thời gian). Với Vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae, đặt ống nuôi cấy ở 37 0C và kiểm tra sau 4 ngày.
• Nhỏ 1 giọt thuốc thử vào dịch nuôi cấy, nếu chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính (màu đỏ ở pH 4,4; màu vàng ở pH 6,0).

Hình 3.2. Chất chỉ thị đỏ methyl chuyển màu khi tiếp xúc
với dịch nuôi cấy vi khuẩn lên men đường.

3.6. Phản ứng V.P. (Voges-Proskauer)
• Môi trường: xem phần 3.5.
• Thuốc thử:
Creatin 0,3% (hoặc để nguyên dạng tinh thể)
NaOH 40%
• Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày.
• Bổ sung NaOH 40 (bằng thể tích dịch nuôi cấy), sau đó nhỏ một ít dung dịch creatin (hoặc thêm một ít tinh thể), đợi khoảng 10 phút (có khi lâu hơn). Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính.
Cách khác:
• Môi trường Clark-Lubs:
Pepton 3 g
K2HPO4 5 g
Glucoza 5 g
pH = 7,5.
• Phản ứng V.P: nhỏ 5 giọt dung dịch alpha naphtol 6% (trong cồn 90%, giữ ở 4 C trước khi dùng) và 5 giọt NaOH 16% (trong nước), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển sang màu đỏ nâu là phản ứng dương tính, màu vàng nhạt là âm tính.
• Phản ứng M.R: nhỏ 2-3 giọt dung dịch Đỏ methyl 0,5% (trong cồn 60%), lắc nhẹ. Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng nhạt hay không màu là âm tính.

Hình 3.3. Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng V.P. và M.R.

 

[canhcutndk16a.]

3.7. Phản ứng ONPG-aza (O-nitrophenyl-β-D-galactopyranosidase)• Môi trường:
ONPG 0,6 g
Đệm phosphat 0,01M pH 7,5 100 ml
Dung dịch pepton 1% (pH 7,5) 300 ml.
(Hoà 0,6 g ONPG trong 100 ml dung dịch đệm, khử trùng bằng màng lọc, sau đó trộn với 300 ml dung dịch pepton đã khử trùng).
Bằng thao tác vô khuẩn phân môi trường vào các ống nghiệm nhỏ, bảo quản ở 4 C trong vòng 1 năm.
• Cắt những khoanh giấy lọc, khử trùng 112 C, 30 phút.
• Nhỏ vào mỗi khoanh giấy lọc một giọt dung dịch sau:
ONPG 0,06 g
Na2HPO4.2H2O 0,017 g
Nước cất 10 ml
Làm khô ở 37 0C trong 24 giờ, bảo quản trong các ống nghiệm có nút xoáy ở nhiệt độ phòng.
• Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (1 vòng que cấy) vào môi trường đã chuẩn bị như trên, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ.
• Ly tâm dịch nuôi cấy thu tế bào, làm dịch huyền phù đậm đặc trong 0,5 ml nước muối sinh lý.
• Đưa khoanh giấy ONPG vào dịch huyền phù, giữ ở 35-37 0C trong 24 giờ.
Quan sát kết quả: màu vàng là phản ứng dương tính (Escherichia coli); không màu là âm tính (Salmonella paratyphi B).

Proteus mirabilis- ONPG (ống thứ 8) âm tính
Serratia marcescens- ONPG (ống thứ 8) dương tính
Hình 3.4. Ví dụ minh hoạ kết quả phản ứng OPNG-aza

 

[canhcutndk16a.]

3.8. Khả năng thủy phân tinh bột
• Môi trường: Bổ sung tinh bột tan (0,2%) vào môi trường nước thịt pepton, khử trùng ở 121 0C trong 20 phút, đổ đĩa Petri.
• Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá cấy vạch hay cấy chấm lên đĩa thạch. Sau 2-5 ngày nhỏ thuốc thử Lugol (xem phần nhuộm Gram) lên vết cấy để quan sát khả năng phân giải tinh bột. Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy tức là vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột.

3.9. Khả năng tạo tinh thể Dextrin• Môi trường: hoà 50 g bột gạo vào 200 ml nước, quấy kỹ, thêm 20 g CaCO3, sau đó bổ sung dần dần 750 ml nước sôi, đồng thời quấy đều rồi đun sôi 10 phút. Phân môi trường vào các ống nghiệm (15 ml/ống), khử trùng ở 121 0C trong 30 phút.
• Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) vào môi trường trên, đặt ở 300C trong 5-10 ngày.
• Bổ sung 1ml dung dịch tinh bột 3%, giữ ở 40 0C trong 15 phút.
• Lấy 3 giọt dịch trong phía trên hoà với 1 giọt dung dịch Lugol và dàn lên phiến kính, làm khô trong không khí và quan sát dưới kính hiển vi.
• Nếu được sản sinh ra, những tinh thể dextrin hình lục giác bắt màu lam có thể quan sát được ở sát mép vết bôi.

3.10. Khả năng phân giải celluloza
• Môi trường khoáng:
NH4NO3 1 g
K2HPO4 0,5 g
KH2PO4¬ 0,5 g
MgSO4. 7H2O 0,5 g
NaCl 1 g
CaCl2 0,1 g
FeCl3 0,02 g
Cao men 0,05 g
Nước cất 1000 ml
pH = 7,0- 7,2.
Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 20 phút.
• Môi trường Pepton:
Pepton 5 g
NaCl 5 g
Nước máy 1000 ml
pH = 7,0-7,2
Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 121 0C trong 20 phút.
• Cho vào ống nghiệm một băng giấy lọc dài 5-7 cm (với vi khuẩn hiếu khí để một phần băng giấy lọc nhô lên khỏi môi trường; với vi khuẩn kỵ khí thỉ để băng giấy lọc ngập trong môi trường).
• Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp, quan sát ảnh hưởng của vi khuẩn tới băng giấy lọc sau 1-4 tuần. Nếu vi khuẩn phát triển và làm nát giấy lọc tức là chúng có khả năng phân giải celluloza (phản ứng dương tính); âm tính là không làm biến đổi giấy lọc.
Cách khác:
• Đổ vào đĩa Petri một lớp thạch 2% (15 ml thạch cho một đĩa  9 cm).
• Bổ sung bột celluloza (0,8%) và thạch (1,5%) vào môi trường ghi ở trên, đổ 5 ml lên trên lớp thạch 2% đã chuẩn bị trong đĩa Petri.
• Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá thành điểm trên môi trường, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1-4 tuần và quan sát vòng phân giải celluloza được tạo ra quanh vết cấy.