[Sinh 10] Tài liệu ( vi sinh vật)

[canhcutndk16a.]

Mô tả một số chi thường gặp:

Chi Rhodococcus:
Phát triển dưới dạng que hoặc khuẩn ty cơ chất phân nhánh. Ở tất cả các chủng, chu trình sống (morphogenetic) đều bắt nguồn từ giai đoạn hình cầu hoặc que ngắn. Bằng cách phân đoạn, các tế bào hình cầu sẽ tạo thành dạng que rồi dạng sợi, sợi phân nhánh và hệ sợi. Một số chủng còn tạo khuẩn ty khí sinh phân nhánh hoặc bó sợi (synnemata). Chúng không có khả năng chuyển động cũng như không hình thành bào tử hay nội bào tử.
Gram dương. Acid-alcohol fast (nhuộm kháng acid-cồn) ở một số giai đoạn phát triển. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Catalase dương tính. Hầu hết các chủng đều mọc tốt trên các môi trường tiêu chuẩn ở 30¬oC, số khác cần thiamin cho sinh trưởng. Khuẩn lạc có thể sần sùi hoặc trơn nhẵn, có màu vàng sẫm, kem, vàng, vàng da cam, đỏ hoặc không màu. Arylsulfatase âm tính, nhạy cảm với lysozyme, không phân hủy được casein, cellulose, chitin, elastin hay xylan. Có thể sử dụng được rất nhiều loại hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng.
Thành tế bào chứa lượng lớn acid meso- diaminopimelic (meso-DAP), arabinose và galactose. Chứa diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamin, phosphatidylinositol mannoside. Thành phần menaquinone chính là MK-8(H¬2) và MK-9(H¬2). Chứa lượng lớn acid tuberculostearic mạch thẳng, không bão hòa và acid mycolic với 32-66 cacbon, với nhiều nhất bốn liên kết đôi. Tỷ lệ mol G+C trong ADN là 63-72%.
Có nhiều trong đất và phân gia súc. Một số chủng gây bệnh cho người và động vật.
Loài chuẩn: Rhodococcus rhodochrous

Chi Nocardioides:
Sợi sơ cấp phân nhánh trên bề mặt, sau đó xâm nhập vàp trong thạch rồi đứt đoạn thành dạng que hay cầu hay không đều. Sợi khí sinh có thể thưa thớt, phân nhánh hoặc không sau đó cũng đứt thành những mẩu ngắn hoặc dạng que. Những mẩu này sẽ là nguồn gốc của những sợi mới. Không có tế bào di động. Khuẩn lạc nhão. Gram dương. Không nhuộm kháng acid ( Non-acid fast ). Catalase dương tính. Hiếu khí bắt buộc. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Mọc dễ dàng trên các môi trường tiêu chuẩn. Nhạy cảm với thực khuẩn thể đặc hiệu. Acid amin chính trong thành tế bào là L-DAP và glycine. Không chứa acid mycolic. Phospholipid chủ yếu là phosphatidylglycerol và acylphosphatidlyglycerol. Acid béo chiếm ưu thế là 14-methylpentadecanoic. Thành phần menaquinone chính là MK-8(H¬4). Tỷ lệ mol G+C trong ADN từ 66,1-72,7%. Có nhiều trong đất.
Loài chuẩn: Nocardioides albus

Chi Pseudonocardia:Sợi khí sinh và sợi cơ chất đều sinh bào tử dạng chuỗi. Sợi phân đoạn, thường có dạng zich-zac với xu hướng phồng lên ở ngọn hoặc ở giữa. Sợi kéo dài bằng cách nảy chồi. Các đoạn sợi có chức năng của bào tử hoặc biến đổi thành bào tử. Thành sợi có hai lớp. Gram dương. Không có giai đoạn di động. Hiếu khí. Sinh trưởng trên nhiều loại môi trường hữu cơ hoặc tổng hợp. Ưa ấm hoặc ưa nhiệt.
Loài chuẩn: Pseudonocardia thermophila

 

[canhcutndk16a.]

Mô tả một số chi thường gặp tiếp)

Chi Saccharopolyspora:
Sợi cơ chất phát triển mạnh, phân nhánh, đứt thành các đoạn dạng que với kích thước 1x5μm, chủ yếu ở những phần già hơn của khuẩn lạc. Khuẩn ty khí sinh phân đoạn tạo các chuỗi bào tử. Gram dương. Không nhuộm kháng acid. Hiếu khí. Khuẩn lạc mỏng, nhô lên, hơi nhăn, sợi khí sinh ít, thường tạo thành chùm, chủ yếu ở những phần già. Có thể sử dụng nhiều loại chất hữu cơ như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, có thể phân giải adenine, kháng nhiều loại chất kháng sinh nhưng nhạy cảm với lysozym. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 77%.
Loài chuẩn: Saccharopolyspora hirsute

Chi Intrasporangium:
Sợi phân nhánh, có xu hướng đứt thành nhiều đoạn có kích thước và hình dáng khác nhau. Không bao giờ có sợi khí sinh. Các túi bào tử hình oval hay hình quả chanh được tạo thành ở giữa hoặc/và ở đầu sợi. Các bào tử không di động. Gram dương. Không nhuộm kháng acid. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Catalase dương tính. Hiếu khí. Mọc tốt nhất ở 28-37oC, không mọc được ở 45oC. Sinh trưởng tốt hơn trên các môi trường chứa peptone và cao thịt. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 68,2%. Thành tế bào chứa L-DAP và glycine. Thành phần phospholipid chủ yếu là một loại phospholipid chứa glucosamin chưa biết. Thành phần acid béo chủ yếu là các acid béo mạch thẳng bão hòa và không bão hòa. Menaquinone chính là MK-8.
Loài chuẩn: Intrasporangium calvum

Chi Actinopolyspora:
Hệ sợi phân nhánh, hình thành rất nhiều sợi khí sinh có đường kính khoảng 1 μm. Sợi cơ chất hầu hết không đứt đoạn. Cuống sinh bào tử chứa 20 hoặc hơn bào tử dạng que ngắn hoặc dạng cầu với vỏ nhẵn hình thành trên sợi khí sinh theo chiều hướng gốc. Sợi cơ chất không sinh bào tử. Gram dương. Nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP, arabinose và galactose. Không chứa acid mycolic. Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 64,2%.
Loài chuẩn: Actinopolyspora halophila

Chi Saccharomonospora:
Chủ yếu sinh bào tử đơn trên sợi khí sinh. Bào tử không bền nhiệt, không có khả năng di động, được hình thành trên các cuống sinh bào tử đơn giản, không phân nhánh, dài ngắn khác nhau. Trên môi trường thạch, hệ sợi dinh dưỡng phân nhánh, bao phủ bởi lớp sợi khí sinh với các bào tử mọc dày đặc dọc trên các sợi. Sợi khí sinh ban đầu có màu trắng rồi chuyển thành xám xanh và xanh sẫm. Sắc tố xanh cũng có ở sợi dinh dưỡng và khuếch tán ra môi trường. Thành tế bào chứa meso-DAP, arabinose và galactose. Không chứa acid mycolic. Chứa lượng lớn iso- và anteiso- acid béo, phosphatidylethanolamin và MK-9(H4). Hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 35-50oC, pH 7-10. Sinh catalase, deaminase và phosphatase. Phân hủy được casein, gelatin, tinh bột. xylan và tyrosin. Đặc biệt có thể sử dụng glycerol làm nguồn cacbon.
Phân lập được trong đất, chất lắng cặn ở hồ, than bùn, thấy nhiều trong phân bón, phân compôt, và cỏ khô. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-74%.
Loài chuẩn: Saccharomonospora viridis

 

[canhcutndk16a.]

Mô tả một số chi thường gặp tiếp)

Chi Frankia:
Không sinh sợi khí sinh. Túi bào tử thường sinh trên cuống sinh bào tử. Bào tử không có khả năng di động với hình dạng không cố định, từ không màu đến màu đen. Trong điều kiện khó khăn như không có quá trình cố định đạm, các túi (vesicle) có thể được hình thành. Gram dương- hoặc Gram không cố định (variable). Hiếu khí hoặc vi hiếu khí. Catalase dương tính. Ưa ấm. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Thường mọc rất chậm (thời gian giữa hai lần phân đôi tế bào là 1-7 ngày). Hầu hết các chủng đều có khả năng cố định nitơ không khí invitro và in planta. Thành tế bào chứa meso-DAP, acid glutamic, alanin, acid muramic, và glucosamine. Thành phần phospholipid gồm phosphatidylinositiol mannoside, phosphatidylinositol và diphosphatidylglycerol. Acid béo dạng thường, mạch thẳng, và không bão hòa. Thành phần đường gồm xylose, madurose hoặc fucose, hoặc chỉ gồm glucose hoặc galactose. Nhiều chủng gồm 2-O-methyl-D-mannose, hầu hết các chủng chứa rhamnose. Hầu hết cộng sinh với một số thực vật hạt kín nhất định, tạo các nốt sần trên rễ ở vật chủ thích hợp. Có thể tìm trong đất. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 66-71%.
Loài chuẩn: Frankia alni

Chi Actinoplanes:
Phát triển dưới dạng sợi phân nhánh, không đứt đoạn. Gram dương, nhưng một phần sợi dinh dưỡng có thể là Gram âm. Không nhuộm kháng acid. Rất ít sợi khí sinh hoặc không có. Tạo nhiều loại sắc tố có khả năng khuếch tán. Bào tử chứa trong túi bào tử, sinh trên cuống sinh bào tử hoặc không cuống, ít khi trong thạch. Dưới điều kiện nhất định, nhiều chủng có hệ sợi sắp xếp dạng que (palisade). Khi đó, túi bào tử chủ yếu được sinh ở đầu các sợi. Bào tử hình cầu hoặc que ngắn, sắp xếp theo nhiều cách khác nhau bên trong túi bào tử, được hình thành bằng cách đứt đoạn sợi bên trong túi bào tử trực tiếp hoặc sau vài lần phân nhánh. Sau khi ngâm trong nước, bào tử di động được giải phóng ra từ túi bào tử, trong một số trường hợp, khả năng di động xuất hiện sau khi bào tử được giải phóng. Bào tử di động chứa tiên mao cực. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa D-xylose và L-arabinose. Thành phần phospholipid chính là phosphatidylethanolamin. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, ưa ấm hoặc ưa nhiệt vừa phải. Hầu hết các chủng đều không cần các nhân tố sinh trưởng hữu cơ. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%.
Loài chuẩn: Actinoplanes philippinensis

Chi Pilimelia:
Túi bào tử được sinh ra trên bề mặt của cơ chất từ cuống sinh bào tử. Túi bào tử có hình cầu, hình trứng, hình quả lê, hình chuông hay hình trụ, có kích thước xấp xỉ 10-15 μm. Túi bào tử chứa rất nhiều bào tử xếp thành chuỗi song song hoặc các hàng cuộn không đều. Gram dương. Khuẩn ty cơ chất có đường kính 0,2-0,8 μm, phân nhánh và có vách ngăn. Khuẩn ty khí sinh thật sự không được hình thành. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Chỉ mọc được trên môi trường hỗn hợp. Khuẩn lạc nhỏ, đặc hoặc mềm. Khuẩn ty cơ chất có màu vàng chanh, vàng, da cam hoặc xanh xám, chuyển sang nâu đến nâu sẫm khi già. Hiếu khí, hóa tự dưỡng hữu cơ, điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở pH 6,5-7,5 và 20-30oC. Có khả năng phân hủy có chất cheratin (lông tóc của động vật có vú). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 72-73%.
Loài chuẩn: Pilimelia terevasa

Chi Dactylosporangium:
Túi bào tử hình ngón tay hoặc hình chùy được hình thành từ cuống sinh bào tử ngắn của khuẩn ty cơ chất. Các túi bào tử phát triển đơn lẻ hoặc tụ thành từng đám trên bề mặt cơ chất. Mỗi túi bào tử chứa một dãy gồm ba đến bốn bào tử. Bào tử có hình chữ nhật, hình elip, hình trứng hoặc hơi trụ, có khả năng di động nhờ một túm tiên mao cực. Không có khuẩn ty khí sinh thực sự. Khuẩn ty cơ chất có đường kính 0,5-1,0 μm, phân nhánh và ít khi có vách ngăn. Gram dương , Không nhuộm kháng acid. Thành tế bào chứa meso-DAP và glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Có khả năng sinh trưởng trên nhiều loại môi trường. Khuẩn lạc đặc, hơi thô, thường phẳng, đôi khi nhô lên một bề mặt trơn hoặc hơi nhăn. Khuẩn ty cơ chất có màu vàng xanh, da cam, đỏ hay nâu. Hiếu khí, hóa tự dưỡng hữu cơ, điều kiện sinh trưởng tối ưu là ở pH 6,0-7,0 và 25-37oC. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%.
Loài chuẩn: Dactylosporangium aurantiacum

 

[canhcutndk16a.]

Chi Micromonospora:
Có hệ sợi sinh trưởng mạnh, phân nhánh, có vách ngăn, đường kính trung bình 0,5 μm. Bào tử không có khả năng di động mọc trực tiếp hoặc từ cuống sinh bào tử. Không có khuẩn ty khí sinh. Gram dương, không nhuộm kháng acid. Thành tế bào bào chứa meso-DAP, và/ hoặc acid 3-hydroxy diaminopimelic, glycin. Thành phần đường chứa xylose và arabinose. Thành phần phospholipid gồm phosphatidylethanolamin, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol mannoside. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H4), MK-10(H4), MK-10(H6) và MK-12(H6). Hiếu khí đến vi hiếu khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhạy cảm với pH dưới 6,0. Có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 20-40oC. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%.
Loài chuẩn: Micromonospora chalcea

Chi Streptomyces:
Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0 μm. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử. Một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất. Bào tử không có khả năng di động. Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó khuẩn ty khí sinh sẽ phát triển rất mạnh mẽ. Sinh nhiều loại sắc tố khác nhau cũng như sắc tố có khả năng khuếch tán ra môi trường. Rất nhiều chủng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất kháng sinh. Hiếu khí, Gram dương, không nhuộm kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính. Thường có khả năng khử nitrate thành nitrit, phân hủy adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthine, tinh bột và L-tyrosine. Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon duy nhất. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25-35 oC, pH tối ưu là 6,5-8,0. Thành tế bào chứa L-DAP, không chứa acid mycolic. Thành phần acid béo gồm phần lớn acid béo bão hòa, iso- và anteiso-. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H6), MK-9(H8¬). Thành phần phospholipid chính là diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol mannoside. Có nhiều trong đất, phân compôt. Một số loài gây bệnh cho người và động vật, một số loài gây bệnh ở thực vật. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-78%.
Loài chuẩn: Streptomyces albus

Chi Actinomadura:
Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh, rất phát triển. Khuẩn ty cơ chất không đứt đoạn, có hoặc không có khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành sẽ hình thành chuỗi ngắn, đôi khi dài của các bào tử đốt (arthrospore). Chuỗi bào tử có thể ở dạng thẳng, uốn cong hoặc xoắn không đều (1-4 vòng). Bề mặt bào tử nhẵn hoặc có các nốt. Khuẩn ty khí sinh khi đã hình thành bào tử có màu trắng, xám hay nâu, vàng, đỏ, xanh lục, xanh lam hay tím. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Nhiệt độ sinh trưởng từ 20 đến 45oC. Một số loài ưa nhiệt. Gram dương. Thành tế bào chứa meso-DAP, không chứa acid mycolic. Tế bào chứa madurose. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H4) và MK-9(H6). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 65-69%.
Loài chuẩn: Actinomadura madurae

Chi Microbispora:
Khuẩn ty khí sinh phân nhánh, hình thành từng cặp hai bao tử gắn với nhau. Bào tử mọc trực tiếp hoặc trên cuống sinh bào tử ngắn, hình cầu hoặc oval, đường kính trung bình 1,2-1,6μm và không có khả năng di động. Thành tế bào chứa acid muramic, meso-DAP nhưng không chứa đường đặc trưng. Thành phần đường của toàn tế bào chứa madurose. Thành phần menaquinone chính là MK-9(H4). Thành phần phospholipid chính chứa phosphatidylcholine và phospholipid chứa glucosamine. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Ưa ấm và ưa nhiệt. Hầu hết các loài để sinh trưởng đều cần các vitamin nhóm B, đặc biệt là thiamin. Trong tự nhiên thường tồn tại trong dầu. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 71-73%.
Loài chuẩn: Microbispora rosea

 

[canhcutndk16a.]

Chi Streptosporangium:
Túi bào tử hình cầu đường kính khoảng 10μm được hình thành trên khuẩn ty khí sinh. Các bào tử được hình thành bằng cách hình thành vách ngăn của sợi cuộn xoắn không phân nhánh bên trong túi bào tử. Bào tử hình cầu, hình oval hoặc hình que, không có khả năng di động. Thành tế bào chứa acid muramic, meso-DAP nhưng không chứa đường đặc trưng. Thành phần đường của toàn tế bào chứa madurose. Thành phần phospholipid chính chứa phosphatidylcholine và phospholipid chứa glucosamine. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Ưa ấm, một số loài có khả năng chịu được nhiệt độ cao. Một số loài cần các vitamin nhóm B cho sinh trưởng. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 69-71%.
Loài chuẩn: Streptosporangium roseum

Chi Thermomonospora:
Khuẩn ty khí sinh sản sinh ra các bào tử đơn lẻ, bền nhiệt, không có khả năng di động. Bào tử có thể sinh trực tiếp nhưng thường là trên đầu của các cuống sinh bào tử có hoặc không phân nhánh. Bào tử cũng có hể được sinh ra từ khuẩn ty cơ chất. Gram dương. Thành tế bào chứa meso-DAP nhưng không chứa các loại acid amin hay đường đặc trưng. Hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ. Cần cung cấp nguồn acid amin và các vitamin cho sinh trưởng như cao nấm men. Tất cả các chủng đều có thể sinh trưởng được ở nhiệt độ 40-48oC, pH 7,0-9,0. pH > 8,0 thích hợp cho sự sản sinh khuẩn ty khí sinh và hình thành bào tử. Sản sinh catalase, deaminase, β-glucosidase và β-galactosidase. Có khả năng phân giải esculin, xylan, casein, gelatin và cacboxymetylcellulose. Bào tử chết ở 90oC trong 30 phút trong nước. Tất cả các chủng đều nhạy cảm với novobiocin (50 μg/ml). Có thể phân lập được từ đất nhưng tồn tại nhiều trong phân bón, phân compôt và cỏ khô đã sấy.
Loài chuẩn: Thermomonospora curvata

Chi Actinosynnema:
Khuẩn ty gồm hai loại là khuẩn ty cơ chất hình thành bó sợi (synnemata) trên bề mặt thạch và khuẩn ty khí sinh hình thành từ bó sợi. Khuẩn ty sinh ra các chuỗi bào tử. Các bào tử có khả năng hình thành tiên mao trong môi trường nước. Thành tế bào chứa meso-DAP, acid glutamic, alanin, glucosamin và acid muramic. Tế bào không chứa thành phần đường đặc trưng. Thành phần phospholipid chính là phosphatidylinositol mannoside, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine và phosphatidylglycerol. Acid béo gồm loại mạch thẳng và mạch nhánh. Thành phần menaquinon chính là MK-9(H4) và MK-9(H6). Gram dương, không acid fast, sinh catalase. Hiếu khí. Ưa ấm. Hóa dị dưỡng hữu cơ. Hầu hết các chủng được phân lập trực tiếp từ mô thực vật như lá cỏ bên bờ sông. Tỷ lệ mol GC trong ADN là 73%.Loài chuẩn: Actinosynnema mirum

Chi Nocardiopsis:
Khuẩn ty cơ chất phát triển mạnh, phân nhánh nhiều, có thể đứt đoạn thành các thể hình cầu và hình que. Khuẩn ty khí sinh dài, phân nhánh không đều, thẳng, uốn hoặc hình zích zắc, đứt đoạn thành các bào tử với chiều dài khác nhau. Bào tử hình oval hoặc kéo dài, bề mặt nhẵn. Gram dương, hiếu khí, hóa dị dưỡng hữu cơ, không nhuộm kháng axít. Thành tế bào chứa meso-DAP, không chứa đường đặc trưng, không có acid mycolic. Thành phần menaquinon chính là MK-10(H2,4,6) hoặc MK-9(H4,6). Tỷ lệ mol GC trong ADN là 64-69%.
Loài chuẩn: Nocardiopsis dassonvillei

 

[canhcutndk16a.]

Dưới đây là hình ảnh một số chi xạ khuẩn thường gặp:

 

[canhcutndk16a.]

Quan hệ phát sinh chủng loại của khoảng 90 chi xạ khuẩn khác nhau:

 

[canhcutndk16a.]

Một số phương pháp phân lập xạ khuẩn:

Phương pháp RC (Rehydration- Centrifugation method): dùng để phân lập xạ khuẩn có khả năng di động- Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu
- Lấy 0,5 g mẫu cho vào 50 ml đệm phosphat 10 mM- 5% cao nấm men (pH 7)
- Loại bỏ phần nổi trên bề mặt
- Giữ ở 28oC trong 1,5 giờ
- Chuyển 8 ml lớp dịch phía trên sang ống ly tâm
- Ly tâm với tốc độ 3000 rpm (1500 x g) trong 20 phút
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
- Chuyển 3 ml lớp dịch trên sang ống khác.
- Lấy 1 ml pha loãng với nước cất (10-3, 10-4)
- Trải trên môi trường HV với độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4
- Nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC trong 14-21 ngày

Phương pháp SDS-YE (Sodium dodecyl sulfate – Yeast extract method): dùng để phân lập tất cả các loại xạ khuẩn
- Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu
- Lấy 1 g mẫu cho vào 10 ml nước cất vô trùng (10-1)
- Lấy 1 ml dịch trên cho vào 9 ml SDS-YE trong đệm phosphat (10-2) (SDS 0,05%, cao nấm men 6%, đệm phosphat 5mM, pH 7,0)
- Sốc nhiệt ở 40oC trong 20 phút
- Pha loãng bằng nước cất vô trùng
- Trải trên môi trường HV
- Nuôi cấy ở 28oC trong 14-21 ngày

Phương pháp DH (Dry heating method): dùng để phân lập xạ khuẩn chủ yếu thuộc chi Streptomyces- Để mẫu khô tự nhiên trong 3-5 ngày, nghiền nhỏ mẫu
- Sấy mẫu ở 100oC trong 30 phút
- Rắc một lượng rất nhỏ mẫu lên môi trường HV
- Nuôi cấy ở 28oC trong 7-14 ngày

 

[canhcutndk16a.]

Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn:

Chuẩn bị thành tế bào
1. Tế bào ướt (1-2 ml) + 5ml nước cất vô trùng + hạt thủy tinh (loại lớn và nhỏ, đường kính 0.11-0.12mm). Phá tế bào bằng sóng siêu âm ca.180 trong 1- 1.5 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong. Chuyển sang ống falcon 50ml. Nếu ngừng công việc ở đây, giữ mẫu ở 4oC.
2. Ly tâm với tốc độ 3000g trong 30 phút. Chuyển dịch trên sang ống ly tâm tốc độ cao (có nắp đậy bên trong). Ly tâm với tốc độ 17000rpm trong 30 phút. Bỏ dịch trên.
3. Thêm 3ml SDS 4% (SDS có tác dụng loại lipid và protein). Nếu dừng công việc ở đây, giữ mẫu ở nhiệt độ phòng.
4. Giữ ở 100oC trong 40 phút, nhớ vặn chặt nắp.
5. Ly tâm với tốc độ 17000 rpm trong 30 phút ở 30oC (nếu giữ ở nhiệt độ thấp, SDS sẽ bị kết tinh). Loại bỏ dịch trên.
6. Rửa với nước ít nhất 3 lần với điều kiện giống trên (17000rpm, 30 phút)
7. Nếu cần thiết, xử lý bằng RNase và DNase.
8. Đông khô qua đêm.

Phân tích thành phần acid amin trong thành tế bào
1. 2-3mg thành tế bào + 200μl HCl 4N, vặn chặt nắp, giữ ở 100oC qua đêm
2. Làm khô bằng hút chân không (khoảng 1 ngày 1 đêm)
3. Thêm 200 μl nước cất, trộn đều, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12000 rpm trong 5 phút. Lọc mẫu.
4. Chạy sắc ký bản mỏng TLC:
- Dung môi:
Methanol 80ml
Nước cất 17.5ml
6N HCl 4ml
Pyridine 10ml
- Cellulose TLC
- Chuẩn (1μl): DAP, Ala, Gly, Glu, Lys
- Mẫu: 3-5μl
- Nhận biết bằng phun ninhydrin, giữ ở 100oC trong 5 phút. Các acid amin sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu tím. Để lâu, các chấm này dần dần biến mất, nhưng riêng chấm của DAP sẽ chuyển sang màu vàng.
5. Chuẩn bị mẫu chạy HPLC: chuẩn bị cho cả mẫu và chuẩn
- 10-20 μl (25nmol) mẫu, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h)
- Thêm 20 μl Ethanol/DW/Triethylamine 2/2/1, trộn đều, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h)
- Thêm 20 μl Ethanol/DW/Triethylamine/Phenylisothiocyanate 7/1/1/1, trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, làm khô bằng hút chân không (khoảng 2h)
- Thêm 0.5ml dung dịch A(dich chạy HPLC), lọc mẫu dùng làm mẫu chạy HPLC

Điều kiện chạy HPLC
- Độ hấp thụ (absorbance) 0.01
- Sử dụng UV detector ở bước sóng 254nm
- Dung dịch A: 6% CH3CN, dung dịch B: 60% CH3CN
- Tốc độ dòng chảy: 1ml/phút

 

[canhcutndk16a.]

Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn tiếp)

Phân tích thành phần menaquinone
1. 100-500mg tế bào khô + 10-15 ml Chloroform: methanol (2:1), trộn bằng khuấy từ chậm trong 2-3 giờ.
2. Chuyển sang ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5-10 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng cô quay
3. Hòa tan bằng 1,5 ml acetone, chuyển sang ống eppendorf, làm khô bằng hút chân không
4. Thêm 50 μl ethanol, chấm toàn bộ mẫu lên bản TLC silicagel, tránh ánh sáng và nhiệt độ cao( không làm khô mẫu bằng máy sấy).
5. Dung môi chạy TLC: Toluen. Sau đó, kiểm tra menaquinone bằng tia UV (thường nằm dưới vạch màu vàng có thể nhìn thấy bằng mắt thường). Chuẩn: Vitamin K. Vạch ngang với vitamin K là menaquinone.
6. Cạo vạch đã được nhận biết bằng UV, cho vào ống eppendorf, thêm 1,5ml acetone, trộn đều.
7. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, làm khô bằng Nitơ lỏng.
8. Thêm 50-100 μl ethanol, lọc và dùng làm mẫu chạy HPLC và Mass spectrometer (MS)
9. Điều kiện chạy HPLC
- Dung môi: Methanol: Propanol (2:1)
- Tốc độ dòng chảy: 0.2ml/min
- Nhiệt độ cột: 40oC
- Nhận biết bằng UV detector với bước sóng 275 nm

Sau khi phân tích, ứng với mỗi pick trên LC, sẽ có pick trên MS. Chỉ số của MS chính là chỉ số m/z, sau đó trừ đi 1(vì MS thêm vào 1 proton), rồi so với giá trị trong bảng sẽ biết được là loại menaquinone nào. Quan trọng nhất là pick cuối cùng và cao nhất (vì menaquinone rất dễ bị đứt gãy). VD: MK-9 (H4) có nghĩa là menaquinone có chứa 9 đơn vị isoprene, trong đó có hai đơn vị isoprene bão hòa. Menaquinone này có thể bị đứt gãy dễ dàng nên xuất hiện các pick nhỏ hơn. Xạ khuẩn có MK 7,8,9,10,11. Một vài loại có MK12.

Phân tích thành phần đường trong tế bào
1. 30-50mg tế bào khô + 1ml H2SO4 1N, lắc nhẹ, vặn chặt nút, giữ ở 100oC trong 2 giờ.
2. Để nguội, chuyển sang cốc thủy tinh, chỉnh pH 5.2-5.5 bằng dung dịch Ba(OH)4 bão hòa.
3. Chuyển sang ống eppendorf. Ly tâm với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút, chuyển dịch trên sang cốc thủy tinh, làm khô bằng hút chân không
4. Hòa tan bằng 300 μl DW, chuyển sang ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 3000rpm trong 5 phút, lấy dịch trên, lọc mẫu.
5. Chạy sắc ký bản mỏng TLC:
- TLC cellulose
- 3 μl mẫu
- 1 μl chuẩn
Chuẩn 1: galactose, arabinose, xylose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước
Chuẩn 2: rhamnose, mannose, glucose, ribose 0.1% (w/v) hòa tan trong nước
Chuẩn 3: madurose (3-O-methyl-D-glucose) 0.1% (w/v) hòa tan trong nước
- Dung môi chạy TLC: n-buthanol:wateryridine:toluene= 10:6:6:1 (v/v)
- Để khô, phun Acidity phthalate aniline (phtalic acid 3.25g hòa tan trong 100 ml dung dịch n-buthanol bão hòa, thêm 2ml aniline). Giữ ở 100oC trong 4 phút
- Chuẩn bị dung dịch n-buthanol bão hòa: DW + n-buthanol (1:1), cho vào bình tách mẫu, lắc trộn đều, loại lớp dưới

Chuẩn 1: Glucose: vàng
Mannose: vàng
Ribose: đỏ
Rhamnose: vàng
Chuẩn 2: Galactose: vàng
Arabinose: đỏArabinose: đỏ
Xylose: đỏ
Chuẩn 3: Madurose: vàng

6. Điều kiện chạy HPLC:
- Cột: cột trao đổi anion
- Dung dịch A: Acid boric 0.1 M
+ Hòa tan 6,2g acid boric trong 1L DW
+ Thêm KOH 4M đến pH 8
- Dung dịch B: Acid boric 0.4M
- + Hòa tan 24,8g acid boric trong 1L DW
+ Thêm KOH 4M đến pH 9
- Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min
- Nhiệt độ: 65oC
- Phản ứng nhận biết:
Dung dịch C: 5g arginine + 15g acid boric trong 500ml DW
Tốc độ dòng chảy: 0,5ml/min
Nhiệt độ: 150oC
Bước sóng: Ex=320nm, Em=430nm
Chương trình
Thời gian (phút) Nồng độ Sol B
0 0 Dung dịch C: 0.2ml/min
50 100 57 100 57.1 0 65 dừng

 

[canhcutndk16a.]

Một số phương pháp hóa phân loại xạ khuẩn tiếp)

Phân tích thành phần acid béo
1. 5mg tế bào khô + dung dịch kiềm (R1) 1ml, vortex 5- 10 sec, giữ ở 100oC trong 5min, vortex 5-10 sec, giữ tiếp ở 100oC trong 25min, để nguội xuống nhiệt độ phòng, có thể đặt trực tiếp dưới vòi nước sau khi hạ xuống 80oC
2. Thêm dung dịch methyl hóa (R2): 2ml, giữ ở 80oC trong 10min, để nguội xuống nhiệt độ phòng. Quá trình này thấy xuất hiện khói trắng
3. Thêm dung dịch tách (R3) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong10min, loại bỏ lớp dưới (lớp nước)
4. Thêm dịch rửa (R4) 3ml, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5 min, ly tâm 2000rpm trong 3min, chuyển 2/3 lớp trên (lớp dung môi) sang ống đựng mẫu (mẫu thường không màu)
5. Nếu lớp phía trên chưa trong, thêm 1-3 giọt dung dịch R5, đảo lộn đầu đuôi nhẹ nhàng trong 5min, ly tâm lại lần nữa.
Chú ý: Các bước cần thực hiện liên tục, trước khi tiến hành cần chuẩn bị heatblock 100 and 80oC.

R1: NaOH 15g, Methanol (HPLC grade) 50 mg, MQ 50ml
R2: 6N HCl 65ml, Methanol (HPLC grade) 55ml, pH 1.5
R3: n-hexane (HPLC grade or n-hexane 1000) 50ml, methyl-ter-butyl ethel (HPLC grade) 50ml
R4: NaOH 10.8g, MQ 900ml
R5: 100ml MQ + 40g NaCl

6. Mẫu được phân tích bằng sắc ký khí (hệ thống MIDI)

 

[canhcutndk16a.]

Phân tích thành phần phospholipid
1. 100mg tế bào khô + dung dịch chlorofolm: methanol: 0,3% NaCl (50:100:40) = 2ml: 4ml:1,6ml . Trộn bằng khuấy từ trong 4 giờ. Chuyển sang ống ống falcon, ly tâm 3000 rpm trong 5 phút.
2. Lấy dịch trên. Thêm 1,75ml NaCl 0.3% và 1,75ml chloroform. Lắc đều, ly tâm 5000 rpm trong 5 phút. Loại lớp trên cùng và lớp giữa.
3. Làm khô bằng Nitơ lỏng. Nếu ngừng công việc, giữ ở -20oC.
4. Hòa tan bằng 100 μl ethanol.
5. Chấm mẫu lên 4 bản HP-TLC (high performance)
6. Dung môi chạy TLC chiều 1:
Chloroform: Methanol: Water = 65:25:4
Dung môi chạy TLC chiều 2:
Trước khi chạy chiều 2, chấm Standard
Chloroform: Acetic acid: Methanol: Water = 80:18:12:5
7. Nhận biết các loại phospholipid:
Bản 1: Nhận biết các glycolipit:
Chuẩn bị thuốc thử anisaldehyde:
Acetic acid 1ml
p-anisaldehyde 5ml
H2SO4 5ml
Ethanol 90ml
Phun thuốc thử, giữ ở 110oC trong 15 phút
Các phospholipid chứa đường như GlcNU chứa NPG và PIMs, glycolipit sẽ hiện lên dưới dạng các chấm màu vàng xanh.

Bản 2: Nhận biết các amino lipit
- Phun ninhydrin lên bản TLC. Giữ ở 120oC trong vài phút.
- Các phospholipid chứa nhóm amino được nhận biết dưới dạng các chấm màu tím đỏ như PE, OH-PE, lyso-PE, PME, PS, NPG
Nhận biết tất cả phospholipid bằng thuốc thử Dittmer Lester
- Chuẩn bị thuốc thử Ditmer Lester:
Sol I 25N H2SO4 100mg
MoO3 4,011g
Hòa tan bằng cách đun ở 90oC đến khi dung dịch trở nên trong
SolII Iot 50mg
Mo 0,178g
Đun trong 15 phút, để nguội, lọc
Trước khi dùng, trộn Sol I + Sol II (1:1) + 1 V nước rồi pha loãng 3 lần. Màu của dung dịch sẽ chuyển từ vàng sang xanh
- Phun thuốc thử lên bản TLC, tất cả các phospholipid sẽ hiện lên

Bản 3: Nhận biết các choline lipit
- Thuốc thử Dragendorff:
Sol A: Basic bismuth nitrate [Bi(OH)2NO3] 1,7g
Acetic acid 20ml
Water 80ml
Sol B: KI 10g
Nước 25ml
Trước khi dùng, trộn 20ml Sol A và 5ml Sol B vào 70ml nước.
- PC và sphingomyelin được nhận biết bằng chấm vàng da cam

Bản 4:
- Giữ bản TLC trong hộp chứa tinh thể Iot trong 3-5 phút. Các chấm vàng và nâu vàng sẽ xuất hiện. Phản ứng dùng để nhận biết tất cả các loại phospholipid.
- Những chấm vàng sẽ dần dần biến mất, có thể sử dụng bản này cho thí nghiệm tiếp theo.
Nhận biết các glycolipit chứa nhóm OH
- Thuốc thử Periodic acid: 1% natri metaperiodic
- Phun thuốc tử periodic acid lên bản TLC. Giữ trong 5-10 phút để nhóm glycol tách khỏi lipit bởi oxi hóa
- Phun nước (loại muối periodate)
- Đặt bản TLC vào bể chứa acid sulfuric cho đến khi các chấm vàng nhận biết bằng Iot biến mất.
- Phun thuốc thử Schiff
- PI hiện lên màu vàng, PG hiện lên màu đỏ đến tím, Các lipit chứa đường hiện lên màu xanh

 

[canhcutndk16a.]

Phân tích thành phần G+C trong ADN
1. 25μl ADN (2-25μg), giữ ở 60oC trong 1 giờ. Giữ ở 100oC trong 2 phút. Làm lạnh lập tức trong chậu đá, spin down.
2. Mẫu ADN 25μl + đệm acetate (40mM, pH 5,3) chứa 2mM ZnSO4 25μl + dung dịch nuclease P1 (20U/ml) 25μl. Spin down. Giữ ở 37oC trong 1 giờ.
3. Glycine buffer (0,1 M, pH 10,4) 25 μl + alkaline phosphatase 2μl (0.35U/μl). Spin down. Giữ ở 37oC trong 1-2 giờ. Sử dụng làm mẫu chạy HPLC
4. Điều kiện HPLC:
- Cột Cosmosil5 C18
- Nhiệt độ 35oC
- Dung môi: 0,2M ammonium phosphat: acetonenitril (40:1)
- Tốc độ dòng chảy: 1 ml/min
- Bước sóng: 275nm

 

[canhcutndk16a.]

Phương pháp tách ADN xạ khuẩn

Phương pháp tách ADN xạ khuẩn
- Nuôi cấy lắc trong 5 ml môi trường dịch thể YG ở nhiệt độ 28oC
- Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy, ly tâm với tốc độ 16000g trong 5 phút ở 4oC, thu sinh khối
- Rửa bằng TE
- Nghiền mẫu
- Thêm 500 μl EDTA 5mM (pH 8,0), trộn đều
- Thêm 50 μl lysozym (0,75 mg trong 1 ml Tris-HCl 10mM pH 8,0), trộn, giữ ở 37oC trong 1 giờ
- Thêm 50 μl SDS 20%, 50 μl proteinase K (4 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), trộn, giữ ở 55oC trong 30 phút
- Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3 lần.
- Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều
- Thu ADN bằng đũa thủy tinh
- Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên
- Thêm 500 μl TE

Nếu sử dụng mẫu ADN để tiến hành thí nghiệm lai ADN, cần làm tiếp các bước sau:

- Thêm 50 μl RNase A (1 mg trong 1 ml Tris-HCl 50mM pH 7,5), 0,5 μl RNase T1, giữ ở 37oC trong 20 phút
- Thêm 50 μl proteinase K, giữ ở 37oC trong 1 giờ
- Thêm 400 μl phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều, ly tâm với tốc dộ 16000g trong 10 phút ở 4oC, thu lớp trên. Thực hiện 3-4 lần.
- Thêm 1/10 thể tích Natriacetate 3M, 1 thể tích propanol, trộn đều
- Thu ADN bằng đũa thủy tinh
- Rửa trong 500 μl ethanol 70% trong 30 giây, để khô tự nhiên
- Thêm 100-200 μl TE

 

[canhcutndk16a.]

Cổ khuẩn(Archaea)

Mở đầu

Những vi sinh vật có khả năng sinh methane (mêtan), mẫn cảm với oxygen và có cấu trúc màng tế bào đặc biệt đã được biết đến từ lâu nhưng mãi đến cuối những năm 1970 chúng mới được nhìn nhận như đại diện của một dạng sống thứ ba trên trái đất bên cạnh vi khuẩn và sinh vật nhân thật, đó là cổ khuẩn. Carl R. Woese và cộng sự (1977) sau khi xem xét trình tự 16S rARN nhận thấy rằng các sinh vật nhân nguyên thuỷ (Prokaryote) cần được chia thành hai nhóm khác biệt nhau hoàn toàn là Vi khuẩn (Eubacteria hay Bacteria) và Cổ khuẩn (Archaeabacteria hay Archaea), và cùng với các Sinh vật nhân thật (Eukarya) làm thành ba lĩnh giới (Domains) ở sinh vật (Hình 1). Các nghiên cứu sâu hơn về phả hệ và đặc điểm sinh lý sinh hoá cho thấy rằng cổ khuẩn được tách ra từ rất sớm trong quá trình tiến hoá, chúng không gần vi khuẩn nhiều hơn so với sinh vật nhân thật, do vậy tên gọi Archaea được đề xuất thay cho Archaeabacteria. Hiện nay cả hai tên gọi Archaea và Archaeabacteria đều được sử dụng trong các tài liệu vi sinh vật, tuy nhiên thuật ngữ Archaea chính xác hơn vì rõ ràng cổ khuẩn không phải vi khuẩn mà là một nhóm vi sinh vật riêng biệt.

Ba lĩnh giới của sinh vật: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và Sinh vật nhân thật (Eukarya).
Cổ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đặc biệt
Cổ khuẩn (Archaea) bắt nguồn từ tiếng La tinh Archaios có nghĩa là cổ, là một nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm rất khác biệt: (Bảng 1).
Bảng 1. Những đặc điểm khác biệt của cổ khuẩn so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật:

 

[canhcutndk16a.]

Thành tế bào

Cũng như tế bào vi khuẩn, tế bào cổ khuẩn (ngoại trừ chi Thermoplasma) có thành tế bào bên ngoài giữ chức năng bảo vệ. Tuy nhiên, không như ở vi khuẩn, thành tế bào của cổ khuẩn không chứa peptidoglycan và vì thế không bị phá huỷ dưới tác dụng của lysozym. Cổ khuẩn có rất nhiều dạng cấu trúc thành tế bào khác nhau. Một số cổ khuẩn (như các loài sinh methane) có thành tế bào cấu tạo bởi một loại polysaccharid rất giống với peptidoglycan được gọi là pseudo-peptidoglycan (pseudomurein). Chuỗi pseudo-peptidoglycan gồm các đơn nguyên N-acetyl-glucosamin và N-acetyl-alosamin-uronic acid (thay cho N-acetyl-muramic acid trong peptidoglycan). Ngoài ra, ở đây cầu nối glycosid 13 thay thế cho cầu nối glycosid 14 ở peptidoglycan. Một số cổ khuẩn khác lại hoàn toàn không có cả peptidoglycan và pseudo-peptidoglycan trong thành tế bào mà thay vào đó là hỗn hợp gồm polysaccharid, glycoprotein hoặc protein. Ví dụ như các loài Methanosarcina (cổ khuẩn sinh methane) có thành tế bào là một lớp polysaccharid dày cấu tạo từ glucoza, glucuronic acid, galactosamin và acetat. Các loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan (extreme halophiles) như là Halococcus có thành tế bào tương tự như Methanosarcina nhưng chứa nhiều hợp chất có nhóm sulfat giống như chondroitin sulfat ở tổ chức liên kết của động vật. Dạng cấu trúc thành tế bào phổ biến nhất ở cổ khuẩn là lớp paracrystallin bề mặt (S-layer) gồm protein hay glycoprotein. Cấu trúc này được tìm thấy ở các đại diện thuộc tất cả các nhóm cổ khuẩn, từ ưa mặn cực đoan (extremely halophilic), ưa nhiệt cực đoan (extremely thermophilic) và cả các loài sinh methane. Đặc biệt các chi Methanospirillum và Methanothrix (cổ khuẩn sinh methane) có cấu trúc thành tế bào vô cùng phức tạp. Các loài thuộc hai chi này mọc thành chuỗi dài gồm nhiều tế bào, ở giữa mỗi cặp tế bào có một lớp đệm dày và toàn bộ cấu trúc chuỗi đó lại được bọc kín trong một lớp paracrystallin bề mặt.

 

[canhcutndk16a.]

Thành tế bào (tiếp):

Thành phần và cấu trúc lipid của màng tế bào là một trong những đặc điểm nổi bật phân biệt cổ khuẩn và hai nhóm còn lại. Trong khi ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật cầu nối acid béoglycerol trong lipid màng tế bào là liên kết este (ester) thì ở cổ khuẩn lại là liên kết ete (ether) (Hình 2). Acid béo trong este-lipid thường là các phân tử ngắn, mạch thẳng. Trái lại, acid béo trong ete-lipid là các phân tử mạch dài, phân nhánh, thuộc cả hai dạng phytanyl (C20cacbuahydro tổng hợp từ isopren) và biphytanyl (C40). Do chỉ có ở cổ khuẩn và không bị biến đổi dưới nhiệt độ cao nên isopren-lipid được lấy làm chất chỉ thị của cổ khuẩn hoá thạch.
Enzyme polymeraza thực hiện quá trình sao mã trên khuôn ADN (DNA-dependent RNA polymerase) ở ba lĩnh giới sinh vật cũng có nhiều điểm khác nhau. Vi khuẩn chỉ có một loại ARN-polymeraza có cấu trúc không gian đơn giản, gồm bốn chuỗi polypeptid 2, 1, 1’ và một nhân tố  không cố định. Cổ khuẩn có nhiều loại ARN-polymeraza, cấu trúc mỗi loại lại phức tạp hơn nhiều so với ARN-polymeraza vi khuẩn. ARN-polymeraza của cổ khuẩn sinh methane và các loài ưa mặn (halophilic) gồm tám chuỗi polypeptid (5 chuỗi dài và 3 chuỗi ngắn). ARN-polymeraza ở cổ khuẩn ưa nhiệt cao (hyper-thermophilic) lại phức tạp hơn, gồm ít nhất 10 chuỗi peptid. Polymeraza thực hiện quá trình tổng hợp ARN thông tin (mARN) ở sinh vật nhân thật gồm 10-12 chuỗi polypeptid có kích thước tương tự như ở ARN-polymeraza của cổ khuẩn ưa nhiệt cao. Ngoài ra, sinh vật nhân thật còn có hai loại ARN-polymeraza khác nữa đặc hiệu cho quá trình tổng hợp ARN của ribosom (rARN) và ARN vận chuyển (tARN). Như vậy chất kháng sinh rifampicin có tác dụng ức chế đơn vị  của polymeraza chỉ có hiệu quả đối với vi khuẩn vì cổ khuẩn và sinh vật nhân thật không có loại polymeraza này.
Với những điểm khác biệt trong trình tự 16S rARN cũng như cấu trúc ARN-polymeraza, hiển nhiên bộ máy sinh tổng hợp protein của ba lĩnh giới sinh vật cũng sẽ không đồng nhất. Tuy có kích thước của ribosom giống với vi khuẩn (70S) nhưng cổ khuẩn lại có nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp protein rất giống với sinh vật nhân thật (80S ribosom). Nhiều chất kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein ở vi khuẩn lại không có hiệu lực đối với cổ khuẩn và sinh vật nhân thật (Bảng 2). Ngoài ra, tương tự như ở sinh vật nhân thật, nhân tố kéo dài EF-2 trong ribosom ở cổ khuẩn có phản ứng với độc tố bạch hầu, một loại độc tố vô hại đối với vi khuẩn. Tuy nhiên nhân tố EF-2 ở cổ khuẩn mang tính đặc hiệu cao, nhân tố này hoàn toàn không hoạt động trong môi trường ribosom của vi khuẩn hoặc sinh vật nhân thật. Các thí nghiệm lai ribosom in vitro cho thấy ribosom ghép giữa đơn vị lớn (50S) của cổ khuẩn và đơn vị nhỏ (40S) của sinh vật nhân thật vẫn thức hiện chức năng giải mã một cách bình thường, trong khi đó việc ghép tương tự giữa vi khuẩn và sinh vật nhân thật lại hoàn toàn không tương thích. Như vậy cấu trúc bộ máy sinh tổng hợp protein của cổ khuẩn có nhiều điểm tương đồng với sinh vật nhân thật hơn là với vi khuẩn.
Giống như vi khuẩn, cổ khuẩn có một nhiễm sắc thể dạng vòng, tuy nhiên genom của cổ khuẩn thường nhỏ hơn nhiều so với genom của vi khuẩn. Chẳng hạn ADN của Escherichia coli là 2,5 x 109 Da, trong khi đó ADN của Thermoplasma acidophilum là 0,8 x 109 Da, hay của Methanobacterium là 1,1 x 109 Da. Ngoài ra thành phần GC (mol%) của ADN ở cổ khuẩn dao động trong phạm vi rất lớn, từ 21 đến 68 %, chứng tỏ tính đa dạng của cổ khuẩn. So sánh trình tự đầy đủ của genom ở cổ khuẩn Methanococcus jannaschi với genom của vi khuẩn và sinh vật nhân thật cho thấy 56% trong 1738 gen không tương đồng.

 

[canhcutndk16a.]

Các hình thức dinh dưỡng ở cổ khuẩn:

Cổ khuẩn có nhiều hình thức dinh dưỡng: hoá dưỡng hữu cơ (chemoorganotrophy), hoá dưỡng vô cơ (chemolithotrophy), tự dưỡng (autotrophy), hay quang hợp (phototrophy). Hoá dưỡng hữu cơ là hình thức dinh dưỡng của nhiều loài cổ khuẩn, tuy nhiên các chu trình phân giải chất hữu cơ thường có một số điểm khác biệt so với vi khuẩn. Cổ khuẩn ưa mặn (halophiles) và ưa nhiệt cực đoan (extreme thermophiles) phân giải glucoza theo một dạng cải biên của con đường Entner-Doudoroff (E-D). Nhiều loài cổ khuẩn lại có khả năng sản sinh ra glucoza từ các chất ban đầu không phải là hydratcarbo (gluconeogenesis) thông qua các bước đảo ngược của quá trình glycolysis (con đường Embden-Meyerhof). Oxygen hoá acetat thành CO2 được thực hiện qua chu trình TCA (đôi khi với một số thay đổi trong các bước phản ứng), hoặc qua con đường acetyl-CoA (Ljungdahl-Wood). Các thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử như ở vi khuẩn đều được tìm thấy ở cổ khuẩn, trong đó cytochroma, b và c có ở các loài ưa mặn cực đại, cytochroma có ở một số loài ưa nhiệt cao. Mô phỏng dựa trên chuỗi chuyển điện tử ở phần lớn cổ khuẩn cho thấy chúng thu nạp điện tử từ chất cho vào chuỗi ở nấc thang NADH, oxygen hoá chất nhận điện tử cuối cùng là O2, S0 hay một số chất khác, đồng thời tạo ra lực đẩy proton (proton motiv force) để tổng hợp ATP nhờ bộ máy ATPaza khư trú trong màng tế bào. Hoá dưỡng vô cơ khá phổ biến ở cổ khuẩn, trong đó hydro thường được sử dụng làm chất cho điện tử.
Tự dưỡng đặc biệt phổ biến ở cổ khuẩn và diễn ra dưới nhiều hình thức khác nhau. Ở cổ khuẩn sinh methane và cổ khuẩn hoá dưỡng vô cơ ưa nhiệt cao CO2 được chuyển hoá thành các hợp chất hữu cơ qua con đường acetyl-CoA, trong đó một số loài có cải biên ở các bước phản ứng khác nhau. Một số loài cổ khuẩn khác (như Thermoproteus) cố định CO2 theo chu trình citric acid đảo ngược, tương tự như ở vi khuẩn lam lưu huỳnh. Mặc dù các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cực đoan đều thực hiện hình thức dinh dưỡng hữu cơ nhưng nhiều loài vẫn có khả năng cố định CO2 và thực hiện quá trình này theo chu trình Calvin, tương tự như ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật.
Khả năng quang hợp có ở một số loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan, tuy nhiên khác với vi khuẩn, quá trình này được thực hiện hoàn toàn không có sự tham gia của chlorophill hay bacteriochlorophill mà nhờ một loại protein ở màng tế bào là bacteriorhodopsin kết gắn với phân tử tương tự như carotenoid có khả năng hấp phụ ánh sáng, xúc tác cho quá trình chuyển proton qua màng nguyên sinh chất và sử dụng để tổng hợp ATP. Tuy nhiên, bằng hình thức quang hợp này cổ khuẩn ưa mặn cực đoan chỉ có thể sinh trưởng với tốc độ thấp trong điều kiện kỵ khí, khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng hữu cơ.

 

[canhcutndk16a.]

Môi trường sống của cổ khuẩn và giả thuyết về hình thành sự sống trên trái đất

Cổ khuẩn được biết đến như những vi sinh vật thích nghi với các môi trường có điều kiện cực đoan (extreme) như nhiệt độ cao (thermophilic), nơi lạnh giá (psychrophilic), nồng độ muối cao (halophilic) hay độ acid cao (acidophilic) v.v. Đó cũng là một lý do giải thích tại sao cổ khuẩn lại khó được phân lập và nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong giới sinh vật, cổ khuẩn có các đại diện cư trú ở các điều kiện nhiệt độ cao hơn cả (Bảng 3, Hình 3), nhiều loài có thể sống ở nhiệt độ trên 100 C dưới áp suất cao như ở các miệng núi lửa dưới đáy đại dương. Cơ chế thích nghi của tế bào vi sinh vật với nhiệt độ cao như vậy còn đang được nghiên cứu. Ở cổ khuẩn, một số phương thức thích nghi với nhiệt độ cao được biết đến như tác dụng của enzyme gyraza trong việc bảo vệ cấu trúc xoắn của ADN dưới tác động của nhiệt, hay ete-lipid, nhất là C40-lipid trong màng tế bào của cổ khuẩn, giúp làm tăng đô bền vững của màng. Tuy nhiên cổ khuẩn không chỉ sống ở các môi trường cực đoan. Ngoài đại dương cổ khuẩn tồn tại với một số lượng lớn. Trên đất liền các loài cổ khuẩn sinh methane ưa ấm có mặt ở nhiều môi trường khác nhau, như các bể lên men chất thải hữu cơ, các chân ruộng lúa ngập nước, đường tiêu hoá của động vật v.v.


Bảng 3. Nhiệt độ phát triển cao nhất của các đại diện sinh vật trên trái đất
Cá 38 oC
Côn trùng 50
Động vật đơn bào 50
Tảo 56
Nấm 60
Vi khuẩn thường 90
Cổ khuẩn 113
Khả năng thích nghi đối với các điều kiện sống cực đoan của cổ khuẩn là cơ sở để giả thuyết rằng chúng là những sinh vật sống đầu tiên xuất hiện trên trái đất. Trái đất của chúng ta trong thời kỳ đầu có nhiệt độ rất cao, khoảng 100 C trở lên, chứa nhiều ammon và khí methane trong khí quyển, do vậy những dạng sống đầu tiên phải là các sinh vật yếm khí và ưa nhiệt cao (hyper-thermophiles). Với các đặc điểm sinh lý như tính ưa nhiệt, sống kỵ khí, sử dụng các chất hữu cơ và vô cơ là nguồn năng lượng, các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cao có lẽ phù hợp với dạng sống nguyên thuỷ mô phỏng theo điều kiện của trái đất trong thời kỳ đầu. Trong thực tế, chất chỉ thị mạch isoprene-lipid thành phần màng tế bào của cổ khuẩn được tìm thấy trong các lớp trầm tích có tuổi là 3,8 tỷ năm. Các nghiên cứu dựa trên trình tự 16S rARN cho thấy cổ khuẩn, đặc biệt là nhóm cổ khuẩn ưa nhiệt cao, tiến hoá chậm hơn đáng kể so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật. Tuy nhiên tốc độ tiến hoá chậm của cổ khuẩn so với hai lĩnh giới còn lại có thể do môi trường sống khắc nghiệt của chúng tạo ra. Cho đến nay câu hỏi về nguồn gốc sự sống và vai trò của cổ khuẩn trong đó vẫn còn đang tiếp tục được tranh luận.
Hình 3. Một trong những nơi đầu tiên cổ khuẩn được tìm thấy: suối nước nóng trong công viên Quốc gia Yellowstone (Mỹ).

 

[canhcutndk16a.]

Phả hệ cổ khuẩn dựa trên trình tự 16S rARN:

Dựa trên so sánh trình tự 16S rARN các đại diện cổ khuẩn đã phân lập được chia thành hai nhóm chính là Euryarchaeota và Crenarchaeota (Hình 4,5). Euryarchaeota là nhóm cổ khuẩn được biết rõ nhất, bao gồm nhiều loài sinh methane, cổ khuẩn ưa mặn, khử sulfat (Archaeoglobales), Thermoplasmalates và Thermococcales. Nhóm Crenarchaeota gồm ba lớp Desulfococcales, Sulfolobales và Thermoproteales. Sau này nhóm cổ khuẩn Korarchaeota được đề xuất thêm (Hình 6), tuy nhiên chỉ dựa trên các trình tự 16S rADN có được từ các mẫu ADN tách trực tiếp từ môi trường chứ chưa có đại diện nào được phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm.

Gần đây (2002), nhóm nghiên cứu của giáo sư Stetter, một trong những nhà nghiên cứu cổ khuẩn hàng đầu thế giới, công bố sự hiện diện của nhóm cổ khuẩn thứ tư, Nanoarchaeota, gồm những cổ khuẩn có kích thước rất nhỏ với một đại diện duy nhất được tìm thấy là Nanoarchaeum equitans (Hình 7). Loài cổ khuẩn này có tế bào hình cầu, đường kính 400 nm, sống bám trên bề mặt tế bào của một loài cổ khuẩn mới Ignicoccus sp., phân lập từ mẫu nước nóng ở độ sâu 106 m dưới đáy biển. Đây là một loài ưa nhiệt cực đoan, phát triển ở nhiệt độ tối ưu 75-98 C. Nhiều trình tự 16S rARDN trực tiếp có được từ môi trường có nhiệt độ cao cũng khẳng định sự tồn tại và khác biệt của nhóm Nanoarchaeota so với các nhóm cổ khuẩn còn lại.