Mỗi enzim đều có một nhiệt độ tối ưu – ở nhiệt độ này enzim sẽ có hoạt tính tối đa làm cho tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất. Nhiệt độ hoạt động nằm trong một giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ cao quá sẽ làm protein bị biến tính dẫn đến enzim cũng bị biến tính, còn ở nhiệt độ quá thấp enzim sẽ ngừng hoạt động.
Ví dụ: Enzim trong nước bọt hoạt động tốt ở nhiệt độ 37 – 40 độ C và bị phá hủy ở nhiệt độ khoảng 100 độ C.